肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，主要包括兩種病理組織學(xué)類型，分別為肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）和肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，iCCA），HCC占我國肝癌總數(shù)的83.9% ~ 92.3%。慢性乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是導(dǎo)致我國肝癌發(fā)生的最主要原因，約85%的肝細(xì)胞癌患者攜帶HBV感染標(biāo)志【1】。TCGA（The Cancer Genome Atlas）等基因組研究工作廣泛揭示了HCC的遺傳學(xué)圖景【2-4】，初步闡明了肝癌的關(guān)鍵基因和信號(hào)通路，但并非所有癌癥的DNA水平變異都具有明確的生物學(xué)意義。肝癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多步驟過程，受到機(jī)體的系統(tǒng)性調(diào)控，尤其對(duì)于感染HBV的肝癌，基因突變會(huì)對(duì)表型產(chǎn)生怎樣的影響，相關(guān)的研究報(bào)道較少。2019年10月3日，復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院樊嘉院士、中國科學(xué)院上海藥物研究所周虎研究員及中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所高大明研究員研究組合作在Cell上發(fā)表題為Integrated Proteogenomic Characterization of HBV-related Hepatocellular Carcinoma的論文。該研究對(duì)159例感染HBV的中國HCC病人的肝細(xì)胞癌（Chinese HCC patients with HBV infection，CHCC-HBV）和配對(duì)癌旁肝組織樣本進(jìn)行了蛋白基因組（proteogenomics）研究，通過檢測(cè)和整合分析基因突變、拷貝數(shù)變異、基因表達(dá)譜、蛋白質(zhì)組及磷酸化蛋白質(zhì)組等多維度組學(xué)數(shù)據(jù)，較為完整地揭示了肝癌腫瘤細(xì)胞的分子特性，全面解析了肝癌的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制，為肝癌的精準(zhǔn)分型與個(gè)體化治療、療效監(jiān)測(cè)和預(yù)后判斷提供了新的思路和策略。圖1 HBV相關(guān)HCC蛋白基因組研究概覽
本研究首先通過解析編碼基因突變圖譜揭示了159例肝癌患者的高頻突變基因，包括TP53（58%）、CTNNB1（19%）、AXIN1（18%）、KEAP1（7%）和RB1（6%）。與TCGA報(bào)道的HBV相關(guān)HCC病人隊(duì)列相比，CHCC-HBV病人隊(duì)列中AXIN1（18% vs 8%）、TSC2（7% vs 0%）、SMARCA2（5% vs 0%）、ATRX（5% vs 0%）和KMT2C（8% vs 0%）突變頻率偏高，而CTNNB1（19% vs 35%）、ARID1A（10% vs 16%）和RB1（6% vs 16%）突變頻率偏低，提示我國HBV相關(guān)HCC人群具有與西方國家不同的基因突變頻譜。由于我國相當(dāng)一部分乙肝患者曾服用中藥治療，而根據(jù)近年來的報(bào)道中草藥含有的I類致癌物馬兜鈴酸（aristolochic acids，AA）可引起肝臟細(xì)胞基因組損傷和產(chǎn)生特殊的基因突變指紋，并有可能促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展【5】。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，本隊(duì)列中約1/3的肝癌樣本中含有馬兜鈴酸相關(guān)的基因突變“指紋”（AA signature），這是目前報(bào)道的含有馬兜鈴酸突變“指紋”的最大樣本量的肝癌隊(duì)列。同時(shí)，利用蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)也檢測(cè)到了由馬兜鈴酸基因突變“指紋”編碼的變異蛋白。有意思的是，馬兜鈴酸的突變“指紋”與腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutational burden，TMB）、腫瘤新抗原（neoantigen）、微環(huán)境免疫耐受（如CD8+ T細(xì)胞浸潤(rùn)，ICOS、OX40、PD-L1和LAG3等免疫檢查點(diǎn)豐度）顯著相關(guān)，提示了對(duì)該類肝癌患者應(yīng)用免疫治療可能會(huì)有特殊的療效。 本研究發(fā)現(xiàn)可以根據(jù)蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)將HBV相關(guān)HCC分為三個(gè)亞型，分別為代謝驅(qū)動(dòng)型（metabolism subgroup，S-Mb）、微環(huán)境失調(diào)型（microenvironment dysregulated subgroup，S-Me）和增殖驅(qū)動(dòng)型（proliferation subgroup，S-Pf），這三個(gè)亞型與基因組穩(wěn)定性、癌栓有無、甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）豐度及RB1和TSC2基因突變等特征顯著相關(guān)。更重要的是，三個(gè)亞型的臨床預(yù)后顯著不同，其中代謝驅(qū)動(dòng)型（S-Mb）的腫瘤中代謝相關(guān)蛋白（如ACAT1、ADH1A、G6PC和PGM1等）相對(duì)高表達(dá)，提示其保留了部分正常肝功能，預(yù)后最好；增殖驅(qū)動(dòng)型（S-Pf）的腫瘤中增殖相關(guān)蛋白相對(duì)高表達(dá)（如PARP1、TOP2A、PCNA和MKI-67等），預(yù)后最差；微環(huán)境失調(diào)型（S-Me）的腫瘤中免疫、炎癥和基質(zhì)相關(guān)蛋白相對(duì)低表達(dá)（CD4、CD8A、S100A12、SPARC和ITGB3），其患者預(yù)后介于增殖驅(qū)動(dòng)型與微環(huán)境失調(diào)型之間。值得指出的是，對(duì)于36例蛋白分型和mRNA分型歸類不一致的樣本，蛋白分型可以提供更好的預(yù)后分離效果（蛋白分型HR=2.194 vs mRNA分型 HR=1.065）。而且，基于蛋白質(zhì)組的分子分型的預(yù)后價(jià)值不依賴于臨床上常用的TNM分期，有望為肝癌的分子分型、個(gè)性化精準(zhǔn)治療和臨床預(yù)后判斷提供指導(dǎo)（圖3）。圖3 HCC三個(gè)亞型與預(yù)后顯著相關(guān)
通過監(jiān)督學(xué)習(xí)（supervised-study）方法，研究人員鑒定到兩個(gè)與預(yù)后顯著相關(guān)的蛋白質(zhì)PYCR2和ADH1A。PYCR2是參與脯氨酸合成的關(guān)鍵酶，與癌旁肝組織樣本相比，在癌組織中顯著高表達(dá)，且表達(dá)越高預(yù)后越差；ADH1A參與肝臟的氧化還原-解毒代謝功能，在癌組織中顯著低表達(dá)，且表達(dá)越低預(yù)后越差。該研究利用獨(dú)立于本研究的組織芯片（含有243個(gè)HBV-HCC樣本）進(jìn)行多色免疫熒光分析，驗(yàn)證了PYCR2和ADH1A表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)性，說明其具有潛在的臨床預(yù)后指示應(yīng)用價(jià)值。該研究還發(fā)現(xiàn)，HBV編碼的mRNA和蛋白質(zhì)在癌組織樣本中表達(dá)低于癌旁組織。SLC10A1是肝臟特異表達(dá)的膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，同時(shí)也是HBV感染肝細(xì)胞的受體。研究發(fā)現(xiàn)SLC10A1表達(dá)水平在癌組織中顯著降低，并與病人的預(yù)后相關(guān)，表達(dá)越低預(yù)后越差。根據(jù)報(bào)道，HBV編碼基因的轉(zhuǎn)錄及膽汁酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)由同一套轉(zhuǎn)錄因子（FXR、RXR等）調(diào)控，這些轉(zhuǎn)錄因子在肝癌組織中的低表達(dá)會(huì)同時(shí)導(dǎo)致膽汁酸代謝受阻和HBV基因表達(dá)下調(diào)，因而是肝癌組織不同于癌旁組織的一個(gè)重要分子特征。作者還發(fā)現(xiàn)，參與肝臟器官特異性代謝的蛋白質(zhì)在腫瘤中表達(dá)下調(diào)，主要包括參與糖異生、解毒和尿素-氨代謝等肝臟特異性的代謝通路。而參與腫瘤細(xì)胞增殖相關(guān)代謝的蛋白質(zhì)，如膽固醇代謝的關(guān)鍵酶（SOAT1、SOAT2和HMGCR等）和谷氨酰胺代謝相關(guān)蛋白（GLS和GLUD2），在腫瘤中表達(dá)上調(diào)。這些數(shù)據(jù)提示了在HBV相關(guān)HCC中，肝臟器官特異性代謝功能的喪失及腫瘤細(xì)胞代謝重編程的激活（圖4）。最后，該研究還利用多組學(xué)數(shù)據(jù)系統(tǒng)性檢測(cè)了細(xì)胞代謝和信號(hào)通路在肝癌中的變化規(guī)律。代謝途徑方面，發(fā)現(xiàn)糖酵解和脂肪酸代謝在癌組織中整體上調(diào)，而膽汁酸代謝整體下調(diào)；而癌組織中的WNT、Hippo-YAP、mTOR信號(hào)通路沒有表現(xiàn)出整體性的上調(diào)，而磷酸化smad2/3信號(hào)在多數(shù)癌組織中上調(diào)，提示TGF-β信號(hào)通路的激活是HBV相關(guān)HCC中一個(gè)較為普遍的特征。該研究還重點(diǎn)關(guān)注了肝癌中最重要的基因突變之一，CTNNB1突變型和野生型肝癌在蛋白質(zhì)和磷酸化位點(diǎn)上的差異，并發(fā)現(xiàn)CTNNB1突變與果糖二磷酸醛縮酶A（ALDOA）第36位絲氨酸（Ser36）的磷酸化相關(guān)。而進(jìn)一步的體內(nèi)外功能研究表明，ALDOA磷酸化促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的無氧糖酵解代謝，并可以顯著促進(jìn)肝癌細(xì)胞的的增殖及裸鼠體內(nèi)成瘤，且在過表達(dá)突變型CTNNB1的肝癌細(xì)胞中敲減ALDOA可以更顯著地抑制細(xì)胞增殖。因此，ALDOA可能是靶向存在CTNNB1突變肝癌的一個(gè)重要潛在靶點(diǎn)。據(jù)悉，樊嘉院士、周虎研究員和高大明研究員為本文共同通訊作者，中山醫(yī)院高強(qiáng)教授、中國科學(xué)院上海藥物研究所朱洪文博士、中山醫(yī)院董良慶博士、至本醫(yī)療施巍煒博士及中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所博士研究生陳然為本文共同第一作者。這項(xiàng)工作得到了美國國立癌癥研究院Henry Rodriguez教授、美國貝勒醫(yī)學(xué)院章冰教授、華盛頓大學(xué)基因研究所Li Ding教授、美國西奈山伊坎醫(yī)學(xué)院Pei Wang教授的大力支持。https:///10.1016/j.cell.2019.08.0521 Prevention of Infection RelatedCancer Group, S. C. o. C. P. et al.[Strategies of primary prevention of liver cancer in China: Expert Consensus(2018)]. Zhonghua zhong liu za zhi[Chinese journal of oncology] 40,550-557, doi:10.3760/cma.j.issn.0253-3766.2018.07.013 (2018).2 Totoki, Y. et al. Trans-ancestry mutational landscape of hepatocellularcarcinoma genomes. Nature genetics 46, 1267-1273, doi:10.1038/ng.3126(2014).3 Schulze, K. et al. Exome sequencing of hepatocellular carcinomas identifiesnew mutational signatures and potential therapeutic targets. Nature genetics 47, 505-511, doi:10.1038/ng.3252 (2015).4 Cancer Genome Atlas ResearchNetwork. Electronic address, w. b. e. & Cancer Genome Atlas Research, N.Comprehensive and Integrative Genomic Characterization of HepatocellularCarcinoma. Cell 169, 1327-1341 e1323, doi:10.1016/j.cell.2017.05.046 (2017).5 Ng, A. W. T. et al. Aristolochic acids and their derivatives are widelyimplicated in liver cancers in Taiwan and throughout Asia. Science translational medicine 9,doi:10.1126/scitranslmed.aan6446 (2017).6 Jiang, Y. et al. Proteomics identifies new therapeutic targets ofearly-stage hepatocellular carcinoma. Nature 567, 257-261,doi:10.1038/s41586-019-0987-8 (2019).
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