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大神一句話，菜鳥跑半年。我不是大神，但我可以縮短你走彎路的半年~ 就像歌兒唱的那樣，如果你不知道該往哪兒走，就留在這學點生信好不好~ 這里有豆豆和花花的學習歷程，從新手到進階，生信路上有你有我！ 豆豆發(fā)送于19.10.1目標：得到了不同的cluster，就可以利用findMarkers()去為每個cluster尋找marker基因。
它的方法是：兩兩cluster之間對每個基因的log表達量進行 Welch t-tests (Soneson and Robinson 2018)。這樣就能找到每個cluster中的差異表達基因（前提是掩蓋掉非生物因素，例如批次信息）。得到的top 差異基因能更好地作為marker基因候選，原因就是：既然它們是最具有差異代表性的，那么利用它們就能區(qū)分不同cluster的細胞，也就實現了marker的目的?！井斎?，還有許多細胞類型自己特有的基因，也是作為marker的候選者】
markers <- findMarkers(sce, my.clusters, block=sce$Plate)
每個cluster與其他cluster的兩兩比較結果會整合到每個cluster的差異基因結果數據框中 例如：看一下第1個cluster的top10差異基因 marker.set <- markers[['1']]
head(marker.set, 10)
## DataFrame with 10 rows and 7 columns
## Top p.value FDR logFC.2
## <integer> <numeric> <numeric> <numeric>
## Aurkb 1 6.65863261824492e-75 1.58362259559721e-70 -7.37163350569914
## Tk1 1 6.41442387689833e-64 3.81385607660686e-60 -4.92754579848056
## Myh11 1 4.95086465211539e-49 9.81220116843835e-46 4.42159318376489
## Cdca8 1 2.22334940769686e-46 3.5251945975503e-43 -6.84273526334783
## Ccna2 2 1.16841222330534e-68 1.38941739534356e-64 -7.3079756458424
## Rrm2 2 1.48873842020081e-56 5.05809512109088e-53 -5.52120322191947
## Cks1b 2 3.83636139889977e-39 2.40105745131667e-36 -6.6792118199827
## Pirb 2 1.83893803490065e-34 6.15992440620318e-32 5.25803749166673
## Pimreg 3 7.41004737119548e-68 5.87443855430467e-64 -7.30454210816126
## Pclaf 3 8.9651722100101e-51 2.13218690670669e-47 -5.60087985621813
## logFC.3 logFC.4 logFC.5
## <numeric> <numeric> <numeric>
## Aurkb -6.72799345321135 -1.95039440976238 -6.91128802096519
## Tk1 -7.74065113926215 -3.53749565362853 -4.63516273649457
## Myh11 4.30812918035861 4.45235717737968 1.0413149433198
## Cdca8 -4.88595092732349 -2.43821402084038 -7.12791471326961
## Ccna2 -6.9676852052539 -2.46589325823089 -7.12692721843331
## Rrm2 -7.94685699818751 -3.19173143688883 -5.42878091964762
## Cks1b -5.92137181826573 -4.37146346518812 -6.214592473138
## Pirb 5.18195596569259 5.87631057587633 0.0704964218555272
## Pimreg -5.91099762335684 -0.874660676141792 -7.01798853404623
## Pclaf -7.56997893312346 -2.36631043435985 -5.16956927698937
可以將全部cluster的marker基因保存起來 write.table(marker.set, file='416B_marker_1.tsv', sep='\t',
quote=FALSE, col.names=NA)
最后熱圖對cluster1的marker基因可視化 top.markers <- rownames(marker.set)[marker.set$Top <= 10]
plotHeatmap(sce, features=top.markers, columns=order(sce$cluster),
colour_columns_by=c('cluster', 'Plate', 'Oncogene'),
cluster_cols=FALSE, center=TRUE, symmetric=TRUE,
zlim=c(-5, 5),
show_colnames = F)
 圖29從圖中粗略地看一看：cluster1包含了處理組（oncogene-induced）細胞，另外第5群也是處理組細胞。如果生物背景足夠的話，也能推斷出這些細胞與某些DE基因之間的聯系。 「需要注意的地方」當然，不是所有的marker基因都在所選cluster都是上調或下調的，它不僅僅是差異基因這么簡單。如果只選差異基因，這樣會過濾掉很多重要的marker基因。 例如，在CD4+-only, CD8+-only, double-positive and double-negative T cells混合的細胞群體中，重要的細胞marker基因Cd4或Cd8 都不會被檢測到，因為這兩個基因會在其中兩個類型的細胞群體中都存在（比如Cd4 會存在于CD4+-only和 double-positive兩種細胞類型中） 這里強烈建議挑選一些已經驗證過的細胞marker基因，比如 CellMarker數據庫（http://biocc./CellMarker/）：整理了100,000+發(fā)表的文獻，包含人的158個組織 (亞組織)的467個細胞類型的13,605個Marker基因，和鼠的81個組織 (亞組織)的389個細胞類型的9, 148個Marker基因 PanglaoDB（https:///）：小鼠的170種組織954個樣本近400W細胞和來自人的68種組織279個樣本100w+細胞 小鼠Mouse Cell Atlas（http://bis./MCA/） signatureDB（https:///signaturedb/）
最好再加上一些定量實驗，比如fluorescent in situ hybridisation or quantitative PCR，確定細胞亞群真實存在，而不僅僅是因為我們分析得到是這樣 作者建議如果只想提取cluster中的上調表達基因，就可以在findMarkers中指定參數direction='up' 。應用在高度異質性群體中，可以更快速判斷不同的cluster findMarkers除了將一個cluster與其他各個cluster兩兩比較之外，還能對某個cluster和其他全部clusters進行差異分析，設置參數pval.type='all' ；如果再和direction='up'連用，就可以用來鑒定每個cluster中特異的marker基因。但是如果存在”過度聚類“的情況，原本一個cluster分成了兩個，那么這個特異的marker基因就不會存在。
另外，這里的p值不能簡單理解為顯著性。具體原因在:https:///packages/3.9/simpleSingleCell/vignettes/de.html#misinterpretation-of-de-$p$-values
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