超過七成的新生兒出現(xiàn)高膽紅素血癥（黃疸），嚴重者可出現(xiàn)特定中樞核團的功能損害，包括腦干聽覺核團、前庭核、下丘核、海馬和小腦浦肯野細胞等癥狀。早在上世紀50年代人們就已經(jīng)認識到，幼年期的聽覺中樞對膽紅素神經(jīng)毒性高度敏感，甚至在“生理性黃疸”狀態(tài)下也可出現(xiàn)聽力損害，表現(xiàn)為急性或緩慢顯癥的感音神經(jīng)性聾。在新生兒重癥監(jiān)護病房和母嬰同室的新生兒中，高膽紅素血癥都是其感音神經(jīng)性聽力障礙發(fā)生的主要高危因素。過半數(shù)的聽神經(jīng)病譜系障礙患者具有明確的新生兒期嚴重黃疸病史，提示膽紅素對聽覺神經(jīng)發(fā)育的長期損害。雖然學(xué)術(shù)界廣泛認同新生兒期高膽紅素血癥容易導(dǎo)致聽覺損傷，但其聽覺損害特征、中樞神經(jīng)毒性機制、幼年易感機制等尚未明確，使得臨床缺乏針對性的防治藥物。近十余年來，筆者所在團隊開展了系列研究，對上述問題進行了初步詮釋。

1 膽紅素所致聽覺損害特征

1.1電生理特征

1.1.1聽性腦干反應(yīng)   聽性腦干反應(yīng)( auditory brainstem response, ABR)主要反映聽覺初級神經(jīng)元至腦干聽覺核團的神經(jīng)電活動，通過測定ABR的波潛伏期和波間期有助于評估聽覺通路興奮性及同步化狀況。ABR作為一項客觀檢查，具有快速、方便、敏感性和特異性高等優(yōu)點，已成為目前臨床嬰幼兒聽力聯(lián)合篩查的常規(guī)檢查之一。我們采用單次腹腔注射膽紅素的方法，制作了一過性的高膽紅素血癥豚鼠模型（生后5~7日豚鼠幼崽，下同），動態(tài)監(jiān)測了ABR各指標在高膽紅素血癥發(fā)生、發(fā)展過程中的變化。通過對完全清醒狀態(tài)下的動物進行ABR測試發(fā)現(xiàn)，高膽紅素血癥可以顯著影響ABR，表現(xiàn)為ABR波Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ潛伏期延長，Ⅰ-Ⅱ波間期、Ⅰ-Ⅲ波間期延長，ABR閾值升高。上述指標的異常程度，均與動物的神經(jīng)行為學(xué)評分存在正相關(guān)，提示ABR可用于臨床評估膽紅素神經(jīng)毒性的嚴重程度。

1.1.2耳聲發(fā)射   耳聲發(fā)射( otoacoustic emission, OAE)可用于評估耳蝸外毛細胞的功能狀態(tài)。對于高膽紅素血癥時耳蝸是否易于受累，學(xué)術(shù)界一直存在爭論。普遍的觀點認為高膽紅素血癥不影響耳蝸的功能，損害部位主要在蝸后。但我們的研究結(jié)果證實，高膽紅素血癥豚鼠各頻率的畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射(distortion product otoacoustic emissions, DPOAE)振幅下降，但始終可以引出，且隨著高膽紅素血癥的的消退而恢復(fù)，說明膽紅素可以損害耳蝸毛細胞耗能的主動機械活動。

1.1.3耳蝸電圖   耳蝸電圖(electrocochleography, ECochG)主要包括三個成分，耳蝸微音電位（cochlear microphonics，CM）、聽神經(jīng)復(fù)合動作電位( compound action potential, CAP)和總和電位( summating potential, SP)。CM和SP來自毛細胞, 都是感受器電位。CM主要反映外毛細胞功能(占80%)，部分反映內(nèi)毛細胞功能(占20%)；CAP是許多聽神經(jīng)單纖維的動作電位疊加的結(jié)果，是反映聽神經(jīng)同步化的重要指標；SP是感受器細胞直流響應(yīng)的反映，與內(nèi)毛細胞關(guān)系密切。我們的實驗結(jié)果顯示在2kHz和8kHz，無論是對照組還是高膽紅素血癥動物的CM振幅均沒有顯著變化。CAP則出現(xiàn)顯著異常：高膽紅素血癥組1kHz、8kHz、32kHz在給藥后8h出現(xiàn)CAP N1潛伏期延長；與神經(jīng)行為學(xué)評分一致的是，72h完全恢復(fù)到最初水平；在給藥后24h出現(xiàn)各頻率CAP振幅下降，72h振幅恢復(fù)至最初水平，但與對照組相比，CAP振幅存在發(fā)育滯后現(xiàn)象。結(jié)合前述試驗，我們發(fā)現(xiàn)膽紅素主要損害聽神經(jīng)信號傳導(dǎo)的同步化，而非毛細胞功能。

1.2形態(tài)學(xué)特征  我們通過對毛細胞、韁孔神經(jīng)纖維及螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元（spiral ganglion neurons）等的顯微、超微結(jié)構(gòu)的定性、定量的形態(tài)學(xué)觀察，揭示了膽紅素所致聽覺外周與中樞的病理損害特征。高膽紅素血癥組給藥8h和10d后，耳蝸基底膜鋪片及毛細胞計數(shù)均無異常，提示膽紅素毒性并不導(dǎo)致內(nèi)外毛細胞的死亡。

然而在給藥8h的高膽紅素血癥組，電鏡觀察到內(nèi)毛細胞（inner hair cell，IHC）底部的I型傳入神經(jīng)末梢顯著損害，甚至呈現(xiàn)完全毀損；給藥10d后，IHC底部的I型傳入神經(jīng)末梢恢復(fù)正常，與對照組動物無明顯差異，IHC線粒體結(jié)構(gòu)保持正常。該研究提示了I型傳入神經(jīng)末梢損害的自我修復(fù)可能，提示了臨床早期治療的重要性。

高膽紅素血癥組在給藥8h后，螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的數(shù)量未見減少，但周圍突和中樞突的神經(jīng)鞘膜均出現(xiàn)了大量空泡，神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)基本保持正常，而且耳蝸底回的聽神經(jīng)纖維數(shù)量明顯減少。在給藥后10d，對應(yīng)于電生理指標的基本恢復(fù)正常，聽神經(jīng)鞘膜空泡消失、結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)；聽神經(jīng)纖維數(shù)量基本恢復(fù)，但仍少于對照組。我們還在激光共聚焦顯微鏡下觀察到，腹側(cè)耳蝸核（ventral cochlear nucleus，VCN）和下丘（inferior colliculus，IC）內(nèi)神經(jīng)元發(fā)生了凋亡，證實了膽紅素的中樞神經(jīng)元損傷（未發(fā)表數(shù)據(jù)）。

2 膽紅素中樞神經(jīng)興奮毒性機制   

既往研究提示，膽紅素神經(jīng)毒性涉及細胞內(nèi)的鈣超載、線粒體受損等多種途徑。雖然具體機制不明，但神經(jīng)興奮毒性被確定是其關(guān)鍵環(huán)節(jié)。膽紅素可能損害細胞膜功能，繼而影響神經(jīng)元興奮性，也可能破壞線粒體功能，導(dǎo)致其內(nèi)鈣釋放、增加細胞內(nèi)Ca2 濃度。Ca2 作為細胞內(nèi)的重要第二信使，可激活多種蛋白酶系統(tǒng)，促使細胞凋亡或壞死。

2.1膽紅素通過促進谷氨酸能突觸傳遞引起聽覺核團神經(jīng)元超興奮   谷氨酸能突觸傳遞是主要的興奮性傳入，但既往研究提示谷氨酸受體并不參與膽紅素興奮毒性。我們使用短桿菌肽穿孔膜片鉗技術(shù)，分離出生后11~14d（P11~14）大鼠的上橄欖外側(cè)核（lateral nucleus of  superior olivary, LSO）神經(jīng)元，記錄其自發(fā)性興奮性突觸后電流（spontaneous excitatory postsynaptic currents, sEPSCs），發(fā)現(xiàn)膽紅素顯著上調(diào)突觸前體的谷氨酸釋放幾率，誘發(fā)突觸后AMPA和NMDA受體開放，導(dǎo)致神經(jīng)元過度興奮。該研究結(jié)果首次確定谷氨酸能突觸傳遞參與膽紅素興奮毒性，糾正了既往的認識。

2.2膽紅素上調(diào)胞內(nèi)游離鈣離子濃度([Ca2 ])

2.2.1膽紅素激活谷氨酸通路、誘發(fā)胞內(nèi)Ca2 超載   谷氨酸受體開放后，Na 、K 、Ca2 等陽離子跨膜進入神經(jīng)元，突觸后膜去極化，誘發(fā)神經(jīng)元動作電位。我們采用鈣指示劑Rhod-2-AM熒光強度測定，觀察VCN神經(jīng)元內(nèi)Ca2 濃度的大小及改變。結(jié)果顯示，在膽紅素(3μM)作用20min后VCN神經(jīng)元熒光強度顯著增加，提示神經(jīng)元[Ca2 ]水平升高。谷氨酸受體阻滯劑NBQX、APV 聯(lián)合作用時，則完全抑制了膽紅素升高VCN神經(jīng)元[Ca2 ]的作用，提示膽紅素效應(yīng)是 NMDA和AMPA谷氨酸受體所介導(dǎo)。

2.2.2膽紅素促進VGCC的開放上調(diào)[Ca2 ]   除了谷氨酸受體之外，細胞外Ca2 流入細胞的主要途徑還包括電壓門控Ca2 通道（voltage-gated calcium channels，VGCC），其是否受到膽紅素影響尚屬未知。我們通過對出生后大鼠幼仔（P4-17）VCN中的叢細胞（bushy cell）進行電壓鉗記錄，證實膽紅素劑量依賴性地增強VGCC介導(dǎo)的Ca2 電流，引起過量Ca2 內(nèi)流，擾亂細胞內(nèi)的Ca2 穩(wěn)態(tài)平衡，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷。

2.3膽紅素促進聽覺神經(jīng)元自發(fā)性內(nèi)源性放電的發(fā)放   

自發(fā)性電活動對整個聽覺通路的形成及完善發(fā)揮重要的作用，但該種自發(fā)性電活動產(chǎn)生的機制及其是否在膽紅素興奮性毒性中發(fā)揮作用尚不清楚。我們通過實驗證實了聽覺中樞神經(jīng)元自發(fā)性內(nèi)源性放電的存在，并且發(fā)現(xiàn)HCN通道在自發(fā)性內(nèi)源性放電的產(chǎn)生機制中起主導(dǎo)作用。進一步的實驗發(fā)現(xiàn)膽紅素可以促進聽覺神經(jīng)元自發(fā)性內(nèi)源性放電的頻率，同時，膽紅素可以直接促進HCN通道的開放，上述結(jié)果提示自發(fā)性內(nèi)源性放電參與了膽紅素興奮毒性機制。

3 發(fā)育早期神經(jīng)中樞的膽紅素毒性易感機制   

相比較成人而言，新生兒的神經(jīng)中樞特別容易受到膽紅素神經(jīng)毒性的影響，出現(xiàn)不同程度的膽紅素腦病、甚至死亡，但其易感機制不明。我們探索了神經(jīng)元在不同發(fā)育時期的生理性差異，以期揭示病理機制。

3.1膽紅素促進發(fā)育早期、去極化效應(yīng)的GABA/甘氨酸能突觸傳遞   GABA和甘氨酸是成年期哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的主要抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，其受體通過介導(dǎo)氯離子內(nèi)流而發(fā)揮超極化作用。針對成年動物，我們既往研究證實了膽紅素對腦干核團GABA/甘氨酸突觸傳遞的促進作用，但此現(xiàn)象不能解釋膽紅素的興奮毒性作用。有研究表明在橄欖核神經(jīng)元，GABA/甘氨酸受體的效應(yīng)在未成年期可表現(xiàn)為興奮作用。我們首先證實了發(fā)育過程中，VCN神經(jīng)元同樣存在GABA/甘氨酸效應(yīng)的逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象，膽紅素可以顯著增加GABA /甘氨酸受體介導(dǎo)的突觸后電流的頻率；使用GABA /甘氨酸受體拮抗劑，可以消除膽紅素誘導(dǎo)的P2~6神經(jīng)元過度興奮，但增加了P15~19神經(jīng)元的自發(fā)性放電頻率。上述研究證明，在出生早期VCN神經(jīng)元，GABA /甘氨酸能突觸傳遞表現(xiàn)為興奮性的電生理效應(yīng)，膽紅素對其、以及對興奮性谷氨酸突觸傳遞的促進作用產(chǎn)生了協(xié)同的超興奮效應(yīng)，從而部分解釋了膽紅素的發(fā)育早期神經(jīng)易感機制。

3.2膽紅素特異性增強P/Q亞型鈣離子通道開放  VGCC通道可分為T、L、N、P/Q和R五種類型，在不同發(fā)育階段各亞型的比重發(fā)生改變。令人驚訝的是，膽紅素特異性增強VCN神經(jīng)元P/Q型、而非其他類型VGCC通道的活性，誘發(fā)顯著增強的鈣離子內(nèi)流；同時，P/Q亞型鈣通道在發(fā)育早期VCN神經(jīng)元中占比最大、成年期占比則較少。因此我們推斷，膽紅素特異性增強P/Q型鈣電流可能也參與了膽紅素神經(jīng)毒性的發(fā)育早期易感機制。

3.3膽紅素促進發(fā)育早期自發(fā)性內(nèi)源性放電頻率   自發(fā)性內(nèi)源性放電在P1~4動物中就已出現(xiàn)并且膽紅素對該時間段的神經(jīng)元毒性更加明顯。我們通過實驗發(fā)現(xiàn)，在P1~4和P15~19動物中，膽紅素都可以促進聽覺神經(jīng)元自發(fā)性內(nèi)源性放電的頻率，但隨著年齡的增大，膽紅素對放電頻率的增加幅度越來越小。因此我們推斷自發(fā)性內(nèi)源性放電可能也是膽紅素腦病早期易感性的基礎(chǔ)。

4 膽紅素神經(jīng)毒性拮抗藥物的探索   

目前，臨床上對高膽紅素血癥患兒主要采取藍光照射及換血療法，主要目的在于消黃，存在一定的滯后性與被動性，臨床缺乏有效防治藥物。我們探討了?；撬?，利魯唑和NAD 對膽紅素神經(jīng)毒性的拮抗作用。

4.1?；撬徂卓鼓懠t素所致聽神經(jīng)損傷   牛磺酸是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最豐富的內(nèi)源性氨基酸之一，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和許多生理過程。我們的實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，?；撬崮軠p輕膽紅素在聽覺系統(tǒng)引起的ECochG和ABR的潛伏期延長、波間距延長和閾值增加，減輕膽紅素誘發(fā)的I型SGNs的脫髓鞘反應(yīng)。雖然膽紅素可顯著增加SD大鼠VCN神經(jīng)元sEPSCs和動作電位的發(fā)放頻率，但此種超興奮作用可被牛磺酸拮抗；GABA/甘氨酸受體阻滯劑可以消除?；撬岬纳窠?jīng)保護作用，提示?；撬嵬ㄟ^激活氯離子內(nèi)流而發(fā)揮保護作用。

4.2利魯唑拮抗膽紅素所致神經(jīng)毒性   利魯唑是1995年獲批準用于治療神經(jīng)變性疾病肌萎縮側(cè)索硬化癥的臨床處方藥物，拮抗谷氨酸所致興奮毒性是其主要作用機制。我們探索了利魯唑?qū)劝彼崮芡挥|傳遞、神經(jīng)元興奮性以及膽紅素引起的神經(jīng)元超興奮性的影響，發(fā)現(xiàn)利魯唑能顯著減少大鼠VCN神經(jīng)元sEPSCs以及動作電位的頻率，但并不影響其幅度；提前或稍后使用利魯唑，均能顯著抑制膽紅素所致sEPSCs 及動作電位頻率的增加、拮抗胞內(nèi)Ca2 超載以及神經(jīng)元的凋亡和壞死，證實利魯唑可以抑制膽紅素神經(jīng)興奮毒性。

4.3 NAD 拮抗膽紅素所致神經(jīng)毒性   煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide, NAD ）是一種重要的小分子物質(zhì)，參與細胞能量代謝、鈣離子平衡、免疫及基因表達等多種生理活動。盡管NAD 在細胞的生物學(xué)功能上發(fā)揮重要作用，但還沒有人關(guān)注NAD 對神經(jīng)元興奮性的作用及其對興奮性毒性的保護作用。我們觀察了NAD 對VCN神經(jīng)元的影響，發(fā)現(xiàn)NAD 可以顯著減小誘發(fā)性興奮性突觸后電流(evoked excitatory postsynaptic currents, eEPSCs)，并逆轉(zhuǎn)膽紅素所致eEPSCs及mEPSCs頻率增加；NAD 可以降低VCN神經(jīng)元自發(fā)性放電的頻率，拮抗膽紅素誘發(fā)的放電頻率增加。上述結(jié)果表明，NAD 通過抑制谷氨酸神經(jīng)遞質(zhì)釋放的途徑，拮抗膽紅素所致神經(jīng)興奮毒性。

5 展望   

雖然膽紅素神經(jīng)毒性的研究已經(jīng)取得了相當?shù)倪M展，但膽紅素對特定核團的選擇性損害機制、膽紅素腦病的遠期后遺癥等均亟待揭示。尤其在認識到膽紅素神經(jīng)毒性存在可逆性時，臨床及時、有效的干預(yù)顯得更為重要。目前依然缺乏針對性的防治藥物，膽紅素神經(jīng)毒性仍嚴重威脅新生兒健康。進一步的深入研究，將為打破瓶頸提供堅實依據(jù)。