如果想知道細胞中轉錄因子或染色質重塑蛋白的結合序列信息，首先會想到染色質免疫共沉淀（ChIP-Seq）技術【1】，然而ChIp-Seq技術對于細胞量要求較大，這樣才能得到超過噪音的有效富集信號。對于可培養(yǎng)的細胞來說這不是個問題，但對于比較難獲得的細胞如早期胚胎細胞，ChIP-seq技術有些力不從心，當然不能否認頡偉組、高紹榮組等曾經利用ChIP-Seq技術分析了植入前胚胎的組蛋白修飾H3K4me3和H3K27me3的序列信息，收集細胞的難度以及該時期的重要性是該工作能發(fā)Nature的原因之一【2】。

新技術—CUT&RUN（cleavage under targets and release using nuclease，核酸酶靶向切割和釋放）的出現(xiàn)使得蛋白-DNA互作研究所需細胞量從ChIP-Seq的10,000降到100-1,000。2019年4月4日，發(fā)表在Cell期刊的Resource文章進一步將該技術升級到單細胞水平，并應用于早期胚胎。他們稱升級版的CUT&RUN 為超低量CUT&RUN（ultra-low input CUT&RUN, uliCUT&RUN）。文章的通訊作者是麻省大學醫(yī)學院的Thomas G. Fazzio教授，共同通訊兼一作是其博后 Sarah J. Hainer，現(xiàn)任匹茲堡大學助理教授。

首先簡單介紹一下CUT&RUN技術，該技術由Henikoff 實驗室開發(fā)，與ChIP-seq相同點是使用抗體，具有特異性。不同點在于：ChIP-seq通常采取蛋白與DNA交聯(lián)，繼而利用超聲打斷DNA，這些步驟會產生背景噪音。CUT&RUN通過針對靶蛋白（如轉錄因子、染色質重塑蛋白）的抗體和Protein A（特異結合免疫球蛋白G）的介導，使與Protein A融合的微球菌核酸酶（Micrococcal Nuclease，MNase）切割并釋放靶蛋白結合的序列，并進一步建庫測序（Figure 1）【3，4】。

圖1． CUT&RUN原理圖

利用磁力珠結合細胞核，然后孵育靶蛋白（如轉錄因子, TF）的抗體和Protein A-MNase，抗體和Protein A-MNase能夠通過核孔進入細胞核，MNase （圖中蟹螯狀圖形）通過Protein A （六邊形） 和抗體的介導切割靶蛋白附近的序列，使用MNase好處在于可以控制酶切過程，因為MNase的活化需要Ca²⁺，可通過加入Ca²⁺或者其螯合劑來啟動和終止反應，進而將靶蛋白結合的序列從細胞核中釋放至上清中，用以建庫【3】。

本文對CUT&RUN技術的改進包括：更換緩沖液、體系溶積、孵育時間、spike-in DNA量以及建庫制備和純化過程的改進。

該課題組利用升級版的uliCUT&RUN技術首先在10-50萬細胞量的小鼠胚胎干細胞（mESCs）中研究CTCF和H3K4me3的序列結合信息。首先選用這兩個蛋白是因為它們在ChIP相關研究中展現(xiàn)很強的抗原表位。將利用該技術獲得的CTCF 或H3K4me3測序結果在這兩種蛋白已知結合位點處（來源于已有文獻ChIP-Seq數(shù)據(jù)）的read密度可視化，發(fā)現(xiàn)10細胞起始量的測序結果可以展現(xiàn)出類似50萬細胞量的結合位點富集熱圖。CTCF的結合區(qū)更為狹窄集中，而H3K4me3則占據(jù)相對寬的區(qū)段。而對照組（無抗體組）的熱圖則沒有這種特征 （圖2）。

圖2. 不同細胞量mESCs的uliCUT&RUN數(shù)據(jù)結果。CTCF（A）和H3K4me3 （B）的結合位點處read密度熱圖，橫向數(shù)字指示不同細胞量，縱軸是文獻報道的ChIP-Seq方法鑒定的結合區(qū)段（已知結合位點）。上下兩排分別是抗體組和無抗體組。

該方法的結合位點檢出率如何呢？以參考文獻中ChIP-Seq方法鑒定的結合位點數(shù)為參照，CTCF實驗組50細胞到50萬細胞量可以檢出57-99%的已知結合位點，10細胞量可以檢測出25-40%，H3K4me3實驗組檢出率稍微低一些，500及以上細胞量可以檢出42%-94%，10-50細胞量能夠檢出23-35%。盡管低細胞量的檢出率不高，但該方法的重復性很好，不同細胞量的數(shù)據(jù)有較高的交集。此外，該方法的特異性也比較高：例如已知的CTCF motif 或同源的CTCFL/BORIS motif 是在不同細胞量樣品中唯一找到的高顯示（over-represented）motif。

作者進一步將此方法應用到其他干細胞相關轉錄因子：OCT4、SOX2 和NANOG以及組蛋白修飾，他們發(fā)現(xiàn)50細胞量就可以獲得較高的檢出率。那么這種方法是否適用于單細胞么？與單細胞RNA-Seq（scRNA-Seq）比較，uliCUT&RUN 應用于單細胞的難點在于一個細胞中蛋白結合DNA的拷貝數(shù)只能是2-4 (取決細胞所在的細胞周期) ，而單細胞中某些轉錄本mRNA的拷貝數(shù)可以達到上千級，所以在單細胞中應用該技術所獲得檢出率并不高，50個單細胞uliCUT&RUN庫集中在一起可以檢出25%的已知CTCF結合位點。在應用于單細胞的SOX2和NANOG uliCUT&RUN時， 能看到模糊但可辨的結合位點富集圖。同時，作者觀察到了單細胞SOX2和NANOG uliCUT&RUN數(shù)據(jù)圖中，在它們共同結合的Pou5f1 超級增強子區(qū)段內有多處富集。提示盡管單細胞數(shù)據(jù)的覆蓋度不高，但這些因子的高結合率位點仍能夠被檢出，顯示其靈敏度。另外單細胞uliCUT&RUN的數(shù)據(jù)結果提示：TF結合位點處的read密度顯示了具有該TF-結合位點互作的細胞比率，只有部分TF結合位點在多數(shù)細胞中顯示被該TF占據(jù)。

uliCUT&RUN 技術的低細胞量要求和高靈敏度使早期胚胎細胞的蛋白-DNA互作研究變得簡單易行。利用該方法，作者發(fā)現(xiàn)了體內環(huán)境下NANOG與其結合位點的互作依賴于SWI/SNF染色質重塑復合體家族成員esBAF的催化組分BRG1。在體外培養(yǎng)的mESCs 中，之前的研究發(fā)現(xiàn)BRG1敲減 后，NANOG對其結合位點的占據(jù)并無顯著變化【5】。然而體外與體內環(huán)境畢竟不同，而BRG1和NANOG在發(fā)育過程中的表達次序提示二者可能有關聯(lián)。BRG1敲降后，30-50 細胞的早期囊胚uliCUT&RUN數(shù)據(jù)顯示NANOG對其結合位點的占據(jù)率明顯降低，而NANOG在內細胞團中的表達量未受影響，提示NANOG在與位點結合之前，需要BRG1打開染色質復雜結構。而這一結果體外培養(yǎng)的mESCs中并沒有看到【5】。

總之，uliCUT&RUN 技術將蛋白—DNA互作研究推進到低細胞量乃至單細胞，仍有較高的靈敏度。這對較難獲得的細胞或組織（如早期胚胎）的研究是一大利好，利用該技術，研究人員在發(fā)現(xiàn)了多潛能性轉錄因子NANOG與其結合位點的互作依賴于SWI/SNF染色質重塑復合體組分BRG1。

原文鏈接：

https:///10.1016/j.cell.2019.03.014

制版人：珂

1. Johnson, DS; Mortazavi, A; et al. (2007). 'Genome-wide mapping of in vivo protein–DNA interactions'. Science, 316, 1497–1502.

2. Liu, X., Wang, C., Liu, W., Li, J., Li, C., Kou, X., Chen, J., Zhao, Y., Gao, H., Wang, H., et al. (2016). Distinct features of H3K4me3 and H3K27me3 chromatin domains in pre-implantation embryos. Nature. 537, 558–562.

3. Skene, P.J., and Henikoff, S. (2017). An efficient targeted nuclease strategy    for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife 6, e21856.

4. Skene, P.J., Henikoff, J.G., and Henikoff, S. (2018). Targeted in situ genomewide profiling with high efficiency for low cell numbers. Nat. Protoc. 13, 1006–1019.

5. King, H.W., and Klose, R.J. (2017). The pioneer factor OCT4 requires the chromatin remodeller BRG1 to support gene regulatory element function in mouse embryonic stem cells. eLife 6, e22631.