首先是GEO甲基化芯片的下載和預(yù)處理。進(jìn)入GEO數(shù)據(jù)庫主頁，也可以通過NCBI官網(wǎng)的GEO DataSets或GEO Profiles進(jìn)入（進(jìn)入NCBI數(shù)據(jù)庫后下拉搜索框）。

主頁搜索框輸入關(guān)鍵詞“Methylation”，點(diǎn)擊search，出來兩行英語，一般選擇第一行的數(shù)字，點(diǎn)進(jìn)去。

頁面跳轉(zhuǎn)到GEO DataSets，這和NCBI中直接進(jìn)入是一樣的，直接輸入需要檢索的腫瘤，或者如下圖點(diǎn)擊Advanced后，在高級(jí)檢索中分別輸入“Colorectal cancer”和“Methylation”，根據(jù)自己的需要選擇合適的甲基化芯片。如果大家知道芯片的GSE號(hào)，也可以直接根據(jù)GSE號(hào)來檢索。

例如，本帖根據(jù)研究內(nèi)容選擇了“GSE29490”這張芯片。

點(diǎn)擊芯片標(biāo)題，則可彈出這張芯片的全部注釋信息。

下拉該頁面，可以看到該芯片的探針平臺(tái)信息，樣本信息，以及矩陣文件(名字Series Matrix File(s)的TXT格式)和原始文件(TAR格式的文件)。一般選擇下載矩陣文件，如果下載原始文件，需要我們自行整理矩陣文件，還是比較麻煩的！

點(diǎn)擊Series Matrix File(s)后，選擇文件的路徑點(diǎn)擊保存。

對(duì)下載好的矩陣文件解壓，使用EXCEL表格打開，如下圖，其中感嘆號(hào)開頭的是注釋文件，將其刪除。

將注釋文件刪除后，把EXCEL里面的矩陣粘貼在txt文檔里，命名為M.txt。

同時(shí)在EXCEL中建立兩列以sample,group分組的表格，對(duì)樣本進(jìn)行分組，C為腫瘤組，T為病例組。將表格粘貼在txt文檔里面，以“group.txt”命名。

將M.txt和group.txt放在同一文件夾里，文件夾名就叫M吧，文件的準(zhǔn)備已告一段落。

接下來，就可以打開Rstdio了(和R軟件運(yùn)行一樣，本質(zhì)也是R軟件，只是界面不同)，做分析之前，需要安裝甲基化芯片相關(guān)的包，這個(gè)過程一般比較慢，大概2h。而通過以下的代碼就可以實(shí)現(xiàn)安裝。對(duì)于這些包的安裝和功能，我們可以參考Bioconductor網(wǎng)站。

分析GEO甲基化芯片需要安裝如下包：

加載安裝包，設(shè)置工作目錄(注意R軟件中工作目錄需要用”\\”或“/”，不可用“\”來設(shè)置工作目錄)，工作目錄直接設(shè)置M文件夾的路徑，然后讀取txt文件。

對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理并輸出結(jié)果

    我們可以看出，標(biāo)準(zhǔn)化處理之前的箱線圖的中位值未處于同一水平線上。

而標(biāo)準(zhǔn)化處理后的箱線圖中所有樣本均處于同一水平線上，使各種實(shí)驗(yàn)條件下的測量可以相互比較，消除測量間的非實(shí)驗(yàn)差異。這樣所有的樣本就具有可比性了。

對(duì)芯片進(jìn)行質(zhì)量控制(QC)，這里需要輸出兩幅質(zhì)量控制的圖：DensityBean圖，MDS圖。

DensityBean圖:圖中可以看出，峰值主要出現(xiàn)在0附近，說明這張芯片的甲基化水平較低。

MDS圖：選出樣本中1000個(gè)變異最大的位點(diǎn)，觀察腫瘤組和對(duì)照組樣本分布情況，在我們實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于這種分布明顯偏離組內(nèi)其他樣本的樣本要予以剔除，因?yàn)檫@樣的樣本對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較大。

甲基化位點(diǎn)的差異分析

dmpFinder函數(shù)，其參數(shù)設(shè)置如下，對(duì)于這些函數(shù)的設(shè)置在R軟件中輸入“?dmpFinder”,運(yùn)行代碼即跳轉(zhuǎn)到參數(shù)設(shè)置頁面，非常方便。

打開文件夾，即可看見dmpDiff命名的甲基化位點(diǎn)的表格，而我們挑選的差異甲基化位點(diǎn)的值則是根據(jù)q-val＜0.05來判定的。

甲基化差異位點(diǎn)制作熱圖：這里是根據(jù)M值(甲基化的率)來做差異甲基化位點(diǎn)的熱圖。

甲基化差異區(qū)域分析

       運(yùn)行代碼后，得到名為dmrs的表格。

      我們?cè)谧黾谆町悈^(qū)域注釋時(shí)候需要五列數(shù)據(jù)：chr，start，end，Ref，Alt。其中Ref，Alt這兩列數(shù)據(jù)缺失，需要手動(dòng)用0補(bǔ)充。

        補(bǔ)充好了之后，就可以對(duì)甲基化芯片差異區(qū)域進(jìn)行注釋了。

   甲基化區(qū)域的注釋，我們采用wANNOVAR網(wǎng)站(http://wannovar./)，進(jìn)入主頁后需要輸入郵箱(機(jī)構(gòu)郵箱)，這里小編也是在網(wǎng)上隨便機(jī)構(gòu)郵箱，這個(gè)網(wǎng)站有點(diǎn)不地道，不支持個(gè)人郵箱！當(dāng)然，只是為了使用這個(gè)網(wǎng)站，不需要郵箱來接受消息。Sample identifer欄隨便輸入英文名稱即可。將上述準(zhǔn)備好的5列數(shù)據(jù)（chr，start，end，Ref，Alt）粘貼在第三個(gè)檢索框里。下拉頁面，在Input Fomat欄里選擇ANNOVAR，然后點(diǎn)擊Submit提交數(shù)據(jù)。

大概幾分鐘的時(shí)間，注釋結(jié)束，便可下載我們剛剛注釋的甲基化區(qū)域了，其中第一行為外顯子區(qū)域結(jié)果，第二行為整個(gè)基因上面的注釋。

打開文件，我們可以看到第6列是甲基化位于基因上的位置，第7列是甲基化區(qū)域所在的基因，第8行是對(duì)甲基化基因的注釋。到這里，我們針對(duì)一張GEO甲基化分析已完成。

    當(dāng)我們得到這些甲基化的基因后，可以對(duì)這些基因進(jìn)行GO、KEGG富集分析，生存分析等，或者去聯(lián)合基因表達(dá)的芯片進(jìn)行分析。作為最大的芯片數(shù)據(jù)庫，因GEO芯片來自用戶的上傳，我們需要對(duì)芯片的質(zhì)量做質(zhì)控，并且做標(biāo)準(zhǔn)化的處理，以盡可能消除對(duì)因?qū)嶒?yàn)條件不同造成的實(shí)驗(yàn)誤差，這一點(diǎn)在TCGA數(shù)據(jù)庫中則不需要。不需要花費(fèi)經(jīng)費(fèi)，只需要大家動(dòng)腦動(dòng)手就能發(fā)SCI，哈哈，這樣的GEO芯片來一打！