肝癌：中國肝癌發(fā)病率居世界之首，且術(shù)后存活率較低。之前的研究表明肝癌組織內(nèi)富含大量腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞，但是相比于免疫療法在黑色素瘤及肺癌等腫瘤上的成果，目前成功針對肝癌的免疫治療方法卻鮮有報道。腫瘤靶點和生物有效標(biāo)志物是新藥研究重難點之一。通過深刻了解肝癌的腫瘤免疫微環(huán)境來探索新的腫瘤免疫療法及尋找新靶點和有效的生物標(biāo)志物對肝癌的診斷和治療具有重大意義。

免疫療法與單細(xì)胞腫瘤組學(xué)： 癌癥免疫療法是近年新興的極具潛力的治療方法，尤其是免疫檢查點抑制劑療法，如CTLA-4抗體Ipilimumab及PD-1抗體pembrolizumab目前都取得了良好的療效。雖然這種治療方法可以達(dá)到顯著的臨床效果，但是在不同病人或者不同癌種之間的效果卻很不均一。DNA變異的數(shù)目、腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的水平，以及藥物靶點的表達(dá)等因素都會影響到各類腫瘤免疫治療的效果。由于參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的免疫細(xì)胞類型多樣且異質(zhì)性很強(qiáng)，只有開展單細(xì)胞水平的研究才能真正獲得系統(tǒng)詳盡的腫瘤免疫圖譜，從而助力腫瘤免疫療法的發(fā)展及有效靶點和生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)。

• filter —— map（GSNAP）

• R function findOverlaps （獲得基因數(shù)據(jù)） —— DESeq 統(tǒng)計 read count —— normalize

•  對于bulk RNA采用的是 GSNAP流程， 對于exome數(shù)據(jù)，過濾去除低質(zhì)量片段，bwa-0.7.12比對，GATK best practice pipeline。體細(xì)胞突變使用Strelka的默認(rèn)參數(shù)找SNV和INDEL，對于低頻突變借助工具IGV手工檢查，CNV和LOH則使用軟件ADTex。
  

• TCR分析： TraCeR，在alpha beta鏈的不同情況選擇

• 聚類方法：modified SC3、 K-means 、 層次聚類 、 ANOVA 、 TukeyHSD 、 t-SNE 、ScLVM

• T細(xì)胞衰竭時期分析：根據(jù)SC3的結(jié)果確定哪些細(xì)胞是衰竭的，再通過DEGs找到差異基因，limma

Tumor Characteristics and Single T Cell Transcriptome Data Generation    腫瘤特征描繪和T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)產(chǎn)生：

• 實驗設(shè)計：

  
  

圖1 試驗設(shè)計

• 樣本選擇：6個未經(jīng)治療的HCC病人

• 數(shù)據(jù)產(chǎn)生流程，實驗方法：

• 對bulk細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq獲得了基本基因表達(dá)譜，CNV和體細(xì)胞變異與先前報道的結(jié)果重合。

• 免疫沉淀鑒定出腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（ILT）

• 多色I(xiàn)HC鑒定出了T細(xì)胞的亞型

• 分離CD4+ T細(xì)胞到兩個亞型：CD25- CD25high

• RNA-seq前的樣本準(zhǔn)備采用了Smart-Seq2方法（(Picelli et al.,2014）以保證沒有3'覆蓋的bias

• 用最顯著差異的基因進(jìn)行分型，結(jié)果如圖2



圖2  聚類分析結(jié)果

• 結(jié)論與發(fā)現(xiàn)：

• 腫瘤中心的CD8+ T細(xì)胞比周圍組織明顯減少。

• CD4+CD25high比正常組織和外周血中的明顯得多，暗示了Treg細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的富集。

• 聚類結(jié)果的分析：

• 分類上的重疊可能暗含功能上的聯(lián)系如：
      - TTC細(xì)胞與NTC細(xì)胞功能上可能有相似；
      - PTC細(xì)胞被分成了明顯的的兩類，分別對應(yīng)CD8+細(xì)胞的激活型和未激活型。

• 文中細(xì)胞類型簡寫說明：

    表1  細(xì)胞類型簡寫說明

T Cell Clustering and Subtype Analysis     亞型分析：

• 本段主要介紹運(yùn)用無監(jiān)督的聚類方法SC3，穩(wěn)定分出11個類別。作者對每一個類別的性質(zhì)和功能進(jìn)行了詳細(xì)的分析。

• 聚類結(jié)果：

• 其中五個簇是有關(guān)CD8+細(xì)胞 6個簇關(guān)于CD4+細(xì)胞。每個簇都擁有特征基因。



圖3  T細(xì)胞亞型 tsne降維與聚類結(jié)果

• 簇分析：

• 第一類：CD8+,C1_CD8-LEF1:
      主要存在外周血，高表達(dá)“未激活”狀態(tài)基因：CEF1，CCR7。

• 第二類：CD8+,C2_CD8-CX3CR1：
      高表達(dá)有關(guān)T細(xì)胞效應(yīng)功能基因：CX3CR1, FCGR3A, 和FGFBP2。

• 第三類：CD8+,C3_CD8-SLC4A10：
      主要由粘膜相關(guān)性T細(xì)胞組成（MAIT），高表達(dá)基因：SLC4A10, ZBTB16, RORC。HCC中MAIT細(xì)胞明顯減少。

• 第四類：CD8+, C4_CD8-LAYN：
      主要與T細(xì)胞衰竭相關(guān)基因：CTLA4,PDCD1,HAVCR2。腫瘤樣本中的衰竭性CD8+細(xì)胞比其他細(xì)胞明顯增多。

• 第五類：CD8+，C5_CD8-GZMK：
      第五類與第四類類似，但是不同在有GZMK基因表達(dá)。

• 第六類：CD4+，C6_CD4-CCR7：
      有高表達(dá)的未激活基因marker如：SELL, TCF7,  CCR7。

• 第七類和第八類都是FOXP3+ Treg細(xì)胞：

• 第十類：T helper細(xì)胞 C10_CD4-CXCL13：
      高表達(dá)：CXCL13, PDCD1, CTLA4, TIGIT。與CD4 T 細(xì)胞的衰竭相關(guān)。

• 第十一類：T helper， C11_CD4-GNLY：
      高表達(dá)：NKG7, GNLY, GZMB與細(xì)胞毒素有關(guān)。

Identification and Confirmation of Genes Uniquely Associated with HCC-Infiltrating Tregs and Exhausted CD8 + T Cells      與肝癌浸潤調(diào)節(jié)細(xì)胞和耗竭型CD8+T細(xì)胞變化相關(guān)基因的確認(rèn)鑒別

• 腫瘤在免疫系統(tǒng)中出現(xiàn)逃逸的主要原因包括殺傷性CD8+T細(xì)胞的功能紊亂及抑制性T細(xì)胞的大量存在，針對這兩類細(xì)胞尋找靶點是免疫療法的主要方向。作者找出了在Treg細(xì)胞中特異表達(dá)的401個基因包括FOXP3, CTLA4, TNFRSF18, TNFRSF4， CCR8，這些基因與之前報道的其他腫瘤特異表達(dá)基因有高度重合。作者還在鑒別出31個先前未報道的Treg標(biāo)志基因，146個與Treg調(diào)節(jié)功能相關(guān)的基因。

• 作者鑒別出了與CD8+衰竭相關(guān)的基因：HAVCR2, PDCD1, ENTPD1, CTLA4, TIGIT, TNFRSF9, CD27。還發(fā)現(xiàn)了癌癥晚期的衰竭程度更高，并且這些與衰竭相關(guān)的基因在腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞中也有高表達(dá)，比如CTLA4、TIGIT。其中一些基因比如PHLDA1、 SNAP47還與預(yù)后相關(guān)。

• 研究方法： limma moderated t test 和 結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)庫分析。

LAYN Is Induced in Blood-Isolated CD8 + T Cells and Tregs upon Activation     在CD8+T細(xì)胞中LAYN基因激活與T調(diào)節(jié)性細(xì)胞的激活

LAYN基因主要編碼layilin（透明質(zhì)酸受體抗體），這種受體被報道在Treg細(xì)胞、腫瘤克隆組織中高表達(dá)。但是缺乏功能描述。在作者的研究中，LAYN在C8（Treg）和C4（衰竭TTC細(xì)胞）中均高表達(dá)，并且還與低生存率相關(guān)。同時LAYN還可以作為CD8細(xì)胞的分類標(biāo)志。
受到抗原刺激后，Treg和CD8+細(xì)胞呈現(xiàn)LAYN大幅度增加，但CD4+卻沒有。作為驗證補(bǔ)充作者還做了體外實驗，激活CD8細(xì)胞獲得LAYN的表達(dá)蛋白，直到6天之后仍然能檢測到。

 圖4        LAYN基因在不同簇間表達(dá)情況與生存曲線分析

 圖5    體外刺激CD8后LAYN表達(dá)情況

Enrichment of Clonal CD8 T Cells and Tregs in HCC Revealed by TCR Identification     TCR鑒別發(fā)現(xiàn)肝癌患者中CD8 T細(xì)胞及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的富集

• 利用單細(xì)胞測序的優(yōu)勢，去分析TCR的α和β序列，希望研究細(xì)胞之間的發(fā)育規(guī)律特征。

• 方法：單細(xì)胞測序、TCR測序（TraCeR）

• 結(jié)果：盡管大多數(shù)單細(xì)胞的TCR不一樣，但是我們還是找到了一些重復(fù)的模式。腫瘤細(xì)胞中的CD8的TCR的相似度是正常組織和癌旁組織的2倍。說明腫瘤組織可能具有更大程度的克隆性。但我們不能否定，可能這些T細(xì)胞是在外周淋巴中產(chǎn)生然后轉(zhuǎn)移到了腫瘤中。

圖6     T細(xì)胞分布與克隆性分析

Mapping Subset Connectivity by Pseudotime State     用機(jī)器學(xué)習(xí)Pseudotime的方法描繪了各個T細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展軌跡

• 完整的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和TCR數(shù)據(jù)讓我們可以得到更多有關(guān)T細(xì)胞效應(yīng)階段和之間的關(guān)系?；镜陌l(fā)育軌跡是：

• CD8：C1（未激活CD8+）——C2（記憶T細(xì)胞）——C5（中間狀態(tài)）——C4（LAYN 衰竭）

• CD4：C6（未激活）——C9（初始聚集）——C10（衰竭CD4）——C11（細(xì)胞毒性T細(xì)胞）



圖7    T細(xì)胞各簇發(fā)育過程分析

• 算法：Monocle 2

• 結(jié)論：基于發(fā)育過程（trajectory）和TCR分析，我們得出衰竭型CD4細(xì)胞和CD8細(xì)胞可以通過GZMA GZMK標(biāo)志來分別鑒別。并且，發(fā)育過程中存在分支，能否阻礙這些分支從而阻止衰竭是可以考慮得研究方向。

Preferential and Clonal Enrichment of Exhausted CD8+ T Cells and Tregs in HCC Microenvironment    克隆CD8 T細(xì)胞以及Treg細(xì)胞會更容易走向衰竭

該研究還描繪了初始T細(xì)胞向耗竭狀態(tài)的發(fā)展軌跡，并在耗竭性CD8 T細(xì)胞亞群中發(fā)現(xiàn)了一類FOXP3+抑制性T細(xì)胞的存在，通過TCR研究得出它們具有發(fā)育上的同源性。提出了耗竭T細(xì)胞會進(jìn)一步發(fā)展成抑制性T細(xì)胞的潛在發(fā)展方向。

高深度的轉(zhuǎn)錄組測序和完整的TCR綜合分析讓我們對腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞有了更深入的了解，并有可能揭示了他們的發(fā)育軌跡。文章提出了HCC相關(guān)的Treg細(xì)胞的標(biāo)志基因（CCR8，LAYN）。LAYN的重要功能是減少IFN-γ的產(chǎn)生，從而抑制了T細(xì)胞的效應(yīng)。通過TCR的研究，我們看到如果能在C5環(huán)節(jié)阻止它們的衰竭而形成更有效的效應(yīng)T細(xì)胞或許是可行的免疫治療方案。另外，對于MAIT細(xì)胞簇（粘膜相關(guān)性T細(xì)胞 ），這一簇的TCR是半突變的。我們知道粘膜是肝臟的第一道防線，觀察到的腫瘤組織中MAIT的減少，與肝癌的發(fā)生發(fā)展有密不可分的聯(lián)系。結(jié)合TCGA的數(shù)據(jù)分析分析，與MAIT相關(guān)的特征基因SLC4A10，與HCC病人的預(yù)后高度相關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

[1]  Chunhong Zheng,  Liangtao Zheng,  Jae-Kwang, et al. Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing[J]. Cell, 2017, 169: 1342-1356.