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免疫組織化學（Immunohistochemistry，IHC）是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑顯色來確定組織細胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對組織切片或細胞標本中的某些多肽和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)進行原位定性、定位或定量研究的實驗技術(shù)。

IHC定量研究中免疫組化圖片該如何分析？今天就使用ImageJ軟件給大家分享免疫組化圖片分析方法。ImageJ軟件是美國NIH開發(fā)的一款在生物醫(yī)學中應用十分廣泛的免費軟件，下載地址為https://imagej./ij/ 。

該軟件的顯著優(yōu)勢是開源、免費，不受電腦系統(tǒng)（官網(wǎng)提供適用不同操作系統(tǒng)的版本）的限制且功能強大。

先前分享的10步填上免疫組織化學（IHC）的坑的文章中介紹了使用IHC Profiler插件對免疫組化結(jié)果進行打分，有興趣可以點這里。今天給大家分享另一種免疫組化圖片分析方法，分享之前先介紹兩個概念：

什么是灰度值（Gray value）？

灰就是不夠黑，介于黑白之間。用于顯示的灰度圖像通常用每個采樣像素8 bit的非線性尺度來保存，這樣可以有256種灰度（8bits即2^8=256）。

使用直線工具沿灰階變化畫直線：

在ImageJ菜單下Analyze，Plot Profile（快捷鍵Ctrl+K）可以找到Plot Profile工具，可得到從純黑變化純白的灰度變化：

純黑灰度值為0，純白灰度值為255，0-255之間即為灰。

免疫組化圖片無組織背景為白色，理論上說灰度值應為255。以一張小鼠肺免疫組化染色為例，將鼠標放于下圖十字處可在紅框處得到圖片的RGB值分別為255,254,255，說明其圖片拍攝條件合理。正確的組化圖片拍攝無組織處背景應為白色。

如何正確進行免疫組化圖片的拍攝？

顯微鏡光源

正確調(diào)整顯微鏡光源為日光色溫的白色光。此時是加藍色濾光片，燈絲電壓為10V左右。一般的顯微鏡上都會有指示的。此時的鏡下視野會感覺明亮得有點刺眼。

不能通過調(diào)整光圈的方法減低亮度，這會影響到圖象的清晰度。光圈與聚光鏡要按照柯勒方法調(diào)整以保證照片的清晰。

不能加過大的灰度鏡減低亮度。用25%的灰度濾光片還行。6%的灰度濾光片會導致色彩失真。

如果照明光源不白，有偏色，將直接影響到照片色彩，從而使得測量結(jié)果不準確。

固定顯微鏡的工作條件

不僅是光源亮度，除了更換樣品時調(diào)節(jié)載物臺位置，其他部件一律固定下來。特別是不要來回切換使用不同放大倍數(shù)的物鏡。使用一個物鏡拍攝所有的照片后，再切換到另一個物鏡上拍攝照片。

為保證顯微鏡光源的穩(wěn)定一致，所有照片應該一次拍攝完成。不能分數(shù)次拍攝。若能給顯微鏡加上穩(wěn)壓電源就更好了。這能保證顯微鏡光源亮度的穩(wěn)定。

應該使用手動控制曝光的相機

對每張照片要使用相同的曝光時間，而不是由相機自動控制曝光。

染色深的陽性樣品就應該拍攝得較暗。染色淺的陰性對照樣品則應該拍攝得較明亮。

控制相機曝光時間

要把相機曝光時間控制到使視野中空白的地方呈現(xiàn)純亮的白色。

拍攝出的照片上，沒有組織的空白處的背景灰度值應達到230左右?？梢允褂脠D象分析軟件測量一下空白處的背景灰度值。低于230的背景灰度值很容易產(chǎn)生色彩的偏離，會影響到圖像分析數(shù)值的偏差。

把空白灰度值調(diào)到230相當于在分光光度計上調(diào)節(jié)100%透射。

避免使用相機的自動白平衡

自動白平衡功能是相機根據(jù)照片總體色彩情況自動對每張照片進行各自不同的白平衡校正。這會嚴重影響分析測量的準確性。顯微鏡照片用一兩種染料染色，照片的色彩就應該是不平衡的，不能校正。由于免疫組化照片上黃色染色多,自動白平衡會將圖片色調(diào)向藍色調(diào)整,導致色彩的失真。

應當把照片存為無損壓縮格式TIFF

保存為jpeg格式后會損失亮度細節(jié)，導致測量誤差增大。要注意相機上直接保存為jpeg的圖片就沒必要轉(zhuǎn)成TIFF了。

總結(jié)

調(diào)整顯微鏡光源亮度，足夠白，足夠亮。

調(diào)整相機曝光時間，使背景呈現(xiàn)白色。灰度值最好能達到230以上。

確認相機未使用自動白平衡功能。但可以使用手動校正白平衡功能校正背景色彩為純白色。

使用同樣的顯微鏡工作條件與相機工作條件一次拍攝完所有照片。

保存照片為TIFF格式。

什么是光密度值（Optical density）？

光密度值即通常所說的OD值，

OD值符合朗伯-比爾定律，其數(shù)學表達式為：

光密度值是直接與染色物質(zhì)量相關(guān)，被測物質(zhì)的量越多，OD值越高，透射出的光越少，反映在照片上就越黑。OD值與灰度值是什么關(guān)系？

其對應關(guān)系如下圖：

灰度值為255，純白處OD值為0，即光100%投射沒有任何物質(zhì)。理論上OD值是從0無窮大。因為值隨光源強度改變而改變，是發(fā)射幅度和入射幅度功率比值的一部分，際應用中，OD值的范圍常用0-2.71。

ImageJ軟件中OD值與灰度值如何轉(zhuǎn)換？

首先將圖片轉(zhuǎn)換為灰度圖片，Image，Type將圖片改為8-bit。

其次在進行轉(zhuǎn)換，Analyze，Calibrate，選擇Uncalibrate OD即可校準。 

此時灰度值255變成了OD值0，灰度值0變成了OD值2.71:

再次以小鼠肺免疫組化染色為例，將鼠標放于下圖十字處可在紅框處得到圖片的OD值為0，括號內(nèi)為對應灰度值為255，OD值為0說明空白背景處沒有任何陽性物質(zhì).此外灰度為0（純黑處）OD值為2.71：

OD值與灰度值分別應該在何種情況下使用，文獻中經(jīng)常會出現(xiàn)的Intensity（a.u.）= Intensity arbitrayr unit，即任意單位。免疫組化圖片分析應該以灰度還是OD值來分析呢？

以灰度來統(tǒng)計的話，無組織背景純白255左右，DAB著色越深灰度值反而越小，這與我們的認知不符。因此，免疫組化圖片分析應該以OD值分析，背景純白OD值接近0，DAB著色越深OD值越大，物質(zhì)的量越多。

免疫組化圖片在對于比較不同組間物質(zhì)的量的多少可能會出現(xiàn)以下三種情況：

1、 DAB著色一樣深，表達面積大的含量多（A<B）：

2、 DAB表達面積一樣大，著色深的含量多（A<B）：

3、 前兩種情況實際情況中不常見。一般情況下，著色深的表達范圍小，表達范圍大的著色淺，該如何比較？

將圖片上各點的光密度值累加起來，得到IOD。此值與目標物質(zhì)的總量成正比。IOD值除以目標分布區(qū)域的面積，得到Average Density（Average Optical Density，AOD） ，此值反映了目標物質(zhì)的單位面積濃度。對樣品照片進行數(shù)字圖像分析比較時，就是比較它們之間的平均光密度值的大小。

計算AOD需要計算積分光密度值IOD與陽性面積。在ImageJ軟件Analyze下選擇Set Measurements設置測量參數(shù)，選擇Integrated density，Area，Limit to threshold（Image -> Adjust -> Threshold 調(diào)節(jié)閾值，紅色代表選中，選擇Limit to threshold只計算紅色選擇的面積），點擊OK。

步驟即為：

1、 打開圖片，Image，type，8-bit將圖片轉(zhuǎn)換為灰度圖片。

將8-bit灰度圖片轉(zhuǎn)換為OD值：Analyze，Calibrate，選擇Uncalibrate OD即可校準。

2、 選擇需要測量的參數(shù)：在ImageJ軟件Analyze下選擇Set Measurements設置測量參數(shù)，選擇Integrated density，Area，Limit to threshold（Image -> Adjust -> Threshold 調(diào)節(jié)閾值，紅色代表選中，選擇Limit to threshold只計算紅色選擇的面積），點擊OK。

Image -> Adjust -> Threshold 調(diào)節(jié)閾值，選擇所有陽性信號（紅色代表選中）：

Analyze，Measure（快捷鍵Ctrl+M），得到結(jié)果：

即該圖片的平均光密度值為0.46。

總結(jié)

免疫組化圖片分析正確首先需要正確的拍攝圖片，其次搞清楚灰度值、光密度值等基本概念再使用軟件進行免疫組化的定量計算即可。

免疫組化圖片分析方法今天就給大家分享到這里，希望對家有所幫助。