一連兩篇Science,兩位合成生物學(xué)大佬，Voigt和Elowitz，同時開發(fā)新的基因線路模式，今天我們首先來學(xué)習(xí)Elowitz的工作。

合成生物學(xué)的一個重要方向是利用基因線路從而使生物計算成為可能，并進(jìn)一步來控制細(xì)胞的行為。最早的基因線路是早在2000年，通過大腸桿菌中實現(xiàn)基因元件的互相抑制來實現(xiàn)，當(dāng)初那篇文章的首要作者即是Elowtiz。

前期的合成生物學(xué)工作主要是基于利用轉(zhuǎn)錄層面的控制，蛋白蛋白之間的偶聯(lián)發(fā)展相對于對于DNA元件的開發(fā)一直進(jìn)展緩慢。然而蛋白質(zhì)水平的電路可以使強(qiáng)大的新細(xì)胞行為工程成為可能。一個可組合的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)系統(tǒng)將有助于合理的蛋白質(zhì)回路設(shè)計，在該系統(tǒng)中，各個蛋白質(zhì)組分可以相互調(diào)節(jié)，從而產(chǎn)生各種不同的回路結(jié)構(gòu)。在這項研究中，Gao等人，展示了工程病毒蛋白酶可以作為可組合的蛋白質(zhì)組分，它們可以一起在哺乳動物細(xì)胞中實現(xiàn)各種各樣的電路級功能。在這個被稱為CHOMP 的系統(tǒng)中，輸入蛋白酶與目標(biāo)蛋白酶對接并切割目標(biāo)蛋白酶以抑制它們的功能。這些組件可以被連接以產(chǎn)生調(diào)節(jié)級聯(lián)、二進(jìn)制邏輯門和動態(tài)模擬信號處理功能。為了證明這個系統(tǒng)的實用性，他們合理地設(shè)計了一個電路，該電路響應(yīng)Ras癌基因的上游激活物而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。因為CHOMP電路可以執(zhí)行復(fù)雜的功能，但仍可以編碼為單個轉(zhuǎn)錄本，無需基因組整合就可以交付，所以它們提供了一個可擴(kuò)展的平臺來促進(jìn)生物技術(shù)應(yīng)用的蛋白質(zhì)電路工程。

合成生物學(xué)尋求能夠合理設(shè)計賦予活細(xì)胞新功能的電路。迄今為止，大多數(shù)努力都集中在基因調(diào)控上，因為轉(zhuǎn)錄因子和其他核酸相互作用蛋白可以相對容易地被配置來調(diào)控彼此的表達(dá)。然而，許多自然細(xì)胞功能是通過蛋白質(zhì)水平的回路來實現(xiàn)的，在這種回路中，蛋白質(zhì)特異性地改變彼此的活性、定位或穩(wěn)定性。例如，caspase介導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡是由一系列蛋白酶調(diào)節(jié)的，這些蛋白酶通過切割相互激活。合成蛋白回路可以提供優(yōu)于基因調(diào)節(jié)回路的優(yōu)勢，包括更快的操作、與內(nèi)源途徑的直接耦合、單轉(zhuǎn)錄物遞送以及無需基因組整合的功能。

關(guān)鍵的挑戰(zhàn)是設(shè)計可組合的蛋白質(zhì)組件，其輸入和輸出是相同類型的，這樣它們可以形成多種蛋白質(zhì)電路，就像一些電子組件可以被連接起來產(chǎn)生多種電子電路一樣。盡管天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域已經(jīng)被結(jié)合來產(chǎn)生具有雜交功能的蛋白質(zhì)，或者用于研究和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。但是缺乏可組合性限制了我們在活細(xì)胞中設(shè)計蛋白質(zhì)水平功能的能力。

病毒蛋白酶為這種系統(tǒng)提供了有希望的基礎(chǔ)。它們中的許多對短同源靶位點(diǎn)表現(xiàn)出很強(qiáng)的特異性，這些位點(diǎn)可以在各種蛋白質(zhì)環(huán)境中被識別和切割。天然病毒多樣性提供了多種具有不同特異性的蛋白酶。病毒蛋白酶可以與強(qiáng)子一起使用來控制蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。他們還可以激活轉(zhuǎn)錄因子、合成的內(nèi)含肽酶原和純化蛋白系統(tǒng)中的其他蛋白酶。

科學(xué)家們首先測試了特性良好的煙草蝕刻病毒蛋白酶( TEVP ) 。為了定量TEVP活性，設(shè)計了一個報告系統(tǒng)，其中在桔黃色熒光蛋白和二氫葉酸還原酶( DHFR ) degron之間插入了同源切割位點(diǎn)( tevs )，作為陽性對照，甲氧芐啶( TMP )可以抑制該位點(diǎn)。我們用表達(dá)TEVP、報道者和mCherry共轉(zhuǎn)染標(biāo)記的不同組合的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胚胎腎( HEK ) 293細(xì)胞，并通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞。

可以看到當(dāng)存在TEVP時候，熒光蛋白則不會被降解。

還設(shè)計了一種互補(bǔ)的可抑制報道系統(tǒng)，其中TEVP裂解暴露了不穩(wěn)定的N末端酪氨酸殘基。這些設(shè)計以直接的方式推廣到相關(guān)的煙草脈斑駁病毒蛋白酶( TVMVP )，并經(jīng)過一些修改，推廣丙型肝炎病毒蛋白酶( HCVP ) 。此外，測量每個報道者對每個蛋白酶的反應(yīng)顯示出有限的交叉活化。因此，三種病毒蛋白酶可用于正交。

為了能夠設(shè)計復(fù)雜的電路，接下來科學(xué)家們尋求蛋白酶-蛋白酶調(diào)節(jié)。設(shè)計了一個方案來調(diào)節(jié)蛋白酶的活性。將反平行異二聚亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域摻入拆分的TEVP 的每一半，以重建其活性。還在亮氨酸拉鏈和TEVP之間插入了HCVP切割位點(diǎn)，以允許HCVP抑制TEVP。最后，將亮氨酸拉鏈(與分裂TEVP上的一個拉鏈互補(bǔ))融合到HCVP上，從而增強(qiáng)了它與TEVP目標(biāo)對接和抑制TEVP目標(biāo)的能力。這種設(shè)計成功地產(chǎn)生了HCVP對TEVP的抑制作用。

為了推廣這種設(shè)計，進(jìn)一步設(shè)計了一種類似的TEVP變體，被TVMVP抑制。基于其與TEVP的序列相似性，還設(shè)計了被HCVP或TEVP抑制的tvmv變體。

使用這個系統(tǒng)，他們設(shè)計了核心電路功能。從布爾邏輯開始，確定了三個設(shè)計原則，這三個原則合在一起足以實現(xiàn)所有八個雙輸入門:第一，在degron和目標(biāo)蛋白質(zhì)之間引入一對連續(xù)的不同切割位點(diǎn)可以實現(xiàn)OR邏輯，因為任何一個位點(diǎn)的切割都足以穩(wěn)定蛋白質(zhì)。其次，為了實現(xiàn)和邏輯，我們在目標(biāo)蛋白的兩側(cè)

N和C末端分別側(cè)接FKBP 和DHFR drogon，每個dragon都有不同的切割位點(diǎn)。在N末端，亮氨酸拉鏈?zhǔn)谴龠M(jìn)輸入蛋白酶對接所必需的。在這種設(shè)計中，為了穩(wěn)定蛋白質(zhì)，去除兩個dragon是必要的。第三，為了實現(xiàn)否定，我們要么使用N -末端degron策略，要么通過中間蛋白酶抑制步驟傳播信號。每個基本門( OR，AND，NOR，作為否定的具體情況)與其輸入的不同濃度的共傳輸揭示了預(yù)期的邏輯功能。此外，改變報告質(zhì)粒的濃度使得能夠在不中斷邏輯計算的情況下調(diào)節(jié)輸出水平，有助于在更復(fù)雜的電路中匹配輸入和輸出水平。最后，通過使用HCVP抑制劑亞松森普雷維和雷帕霉素誘導(dǎo)的TEVP，我們發(fā)現(xiàn)這些門也可以由小分子輸入控制。因此，這些結(jié)果表明，三個核心門在多種輸入方法中表現(xiàn)出穩(wěn)健和可調(diào)的操作。

除了布爾邏輯之外，模擬信號濾波還可以實現(xiàn)許多細(xì)胞功能，例如選擇性響應(yīng)特定輸入濃度范圍的能力。非相干前饋回路( IFFL )為該功能提供了一個簡單的實現(xiàn)方式，在該線路中，輸入既激活又抑制同一目標(biāo)。在IFFL的啟發(fā)下，他們將激活臂和抑制臂結(jié)合起來，在激活臂中，TEVP去除了C末端的degron，在抑制臂中，tvmv展示了不穩(wěn)定的N末端酪氨酸。為了調(diào)整帶通的位置和銳度，我們還引入了基于抑制臂上HCVP和tvmv之間的相互抑制的正反饋回路，使得HCVP表達(dá)量為tvmv活動設(shè)定了閾值。

為了能夠在Ras激活發(fā)生的質(zhì)膜上高效地依賴蛋白酶誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，通過從人類H - Ras 的C末端摻入20個氨基酸的膜靶向序列( MTS )，對TEVP激活的casp 3變體進(jìn)行了定位。

接下來，為了將Ras激活輸入耦合到TEVP，將TEVP的N端半部分融合到Ras，其C端半部分融合到Raf的Ras結(jié)合結(jié)構(gòu)域( RBD )，后者結(jié)合到活性形式的Ras (。在這個設(shè)計中，Ras的上游激活器應(yīng)該重建RasTEVP ，從而激活casp 3。

與轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)相比，CHOMP電路可以提供不同的功能。就速度而言，蛋白酶可以快速響應(yīng)輸入蛋白酶活性的增加。CHOMP電路也可以在細(xì)胞內(nèi)的特定亞細(xì)胞位置并行工作。因為CHOMP電路具有相對緊湊的基因設(shè)計，并且不需要與DNA的調(diào)節(jié)性相互作用，所以它們可以通過基因治療載體或其他病毒被引入分化的甚至死后的細(xì)胞中，并且可以提高溶瘤病毒治療的特異性。綜合來看，將轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)節(jié)與工程蛋白酶結(jié)合起來的混合電路可以提供堿基配對相互作用的可編程性以及蛋白質(zhì)水平的操作。例如，現(xiàn)有的癌癥檢測電路可以有條件地表達(dá)CHOMP成分，以增加特異性，并耦合到蛋白質(zhì)介導(dǎo)的輸入和輸出。綜合這些能力，人們可以想象基于CHOMP電路的智能療法。