首先，比較下翻譯組相關(guān)的兩個不同技術(shù)。廣義的翻譯組（Translatome）測序包括兩大類：多聚核糖體測序（polyribosome profiling）和核糖體印記測序（Ribosome footprints profiling）。雖然可以統(tǒng)稱為翻譯組，但這兩類測序方法本質(zhì)是實(shí)驗(yàn)方法的不同，對應(yīng)的兩種方法所得到的數(shù)據(jù)的功能也不同。

在講翻譯組的方法前，我們先要了解蔗糖密度梯度離心法。該方法的基本原理是：當(dāng)我們向一個離心管中加入不同濃度（例如5%和20%）的蔗糖溶液。在短時(shí)間內(nèi)，兩個溶液層不會互溶，而是由于密度不同，而呈現(xiàn)分層。

當(dāng)向這個分層的離心管中加入分子樣本，并進(jìn)行超速離心后，不但不同密度（濃度）的蔗糖溶液會呈現(xiàn)分層，而且樣本中不同分子量的物質(zhì)也將懸浮在不同密度的蔗糖溶液中。通過分取特定濃度的蔗糖溶液層，就可以富集懸浮在其中的特定分子量的物質(zhì)。

圖1 蔗糖密度梯度離心法

多聚核糖體測序（polyribosome profiling），在某些文獻(xiàn)里面，又被稱為核糖體新生肽鏈復(fù)合物結(jié)合的mRNA測序（ribosome nascent-chain complex-bound mRNAs sequencing），簡稱RNC-seq，通常是直接通過蔗糖密度梯度超速離心的方法，將與多個核糖體結(jié)合的全長mRNA進(jìn)行富集并測序。

該方法的基本原理是：由于mRNA與核糖體結(jié)合形成復(fù)合物后，分子量會提高。且單條mRNA結(jié)合的核糖體越多，復(fù)合物的分子量越大。通常1條mRNA模版可以同時(shí)結(jié)合多個核糖體，從而并行合成多個蛋白分子，因此正在翻譯的mRNA分子會與多個核糖體形成多聚核糖體復(fù)合物（Polysomes），通常會懸浮在高密度的蔗糖溶液層中（見下圖）。從高密度的蔗糖溶液層中，就自然可以分離正在翻譯的mRNA分子。

因此，多聚核糖體測序富集的第一步，是得到全長的與核糖體結(jié)合的mRNA分子。后續(xù)的實(shí)驗(yàn)步驟則與RNA-seq完全相同，結(jié)果與RNA-seq也極為相似。 

圖2 蔗糖密度梯度離心分離多聚核糖體復(fù)合物示意圖。

X軸對應(yīng)蔗糖溶液的不同濃度層，Y軸是對應(yīng)濃度層的吸光度（就是懸浮期間的物質(zhì)量）

核糖體印記測序（Ribosome footprints profiling），簡稱Ribo-seq，其實(shí)驗(yàn)步驟如圖3。相比RNC-seq，核糖體印記測序最大的區(qū)別是加入了核酸酶消化這個步驟。在酶切這個步驟，會導(dǎo)致沒有被核糖體大小亞基保護(hù)的mRNA片段被降解，而保留下的mRNA片段（平均長度約為28nt）才是真正的正在被核糖體結(jié)合，正在翻譯的mRNA片段。

這些被核糖體結(jié)合的mRNA片段，看起來像核糖體在翻譯的瞬間在mRNA上留下的足跡，所以這些mRNA片段又被稱為核糖體印記（Ribosome footprints，簡稱RFs），這就是核糖體印記測序這個名稱的由來。

圖3 核糖體印記測序（Ribosome profiling）的實(shí)驗(yàn)步驟

核糖體印記（RFs）檢測翻譯進(jìn)行程度的精度，是單密碼子級別的。大部分生物核糖體保護(hù)的mRNA片段長度約為28nt，即RFs的理論長度為28nt。從這個信息就可以獲得核糖體內(nèi)部翻譯的全部信息。

以核糖體中肽鏈合成延伸的關(guān)鍵位點(diǎn)A位點(diǎn)為例。與A位點(diǎn)結(jié)合的密碼子就是對應(yīng)正在合成的氨基酸，這個位置位于整個RFs第16~18個堿基的位置。因此，我們只要獲得RFs信息，就可以獲得對應(yīng)的mRNA序列翻譯的豐富信息，包括： 

（1）序列中的哪些位置可以被翻譯。

（2）一段序列理論上不止一個開放閱讀，到底哪個才是真實(shí)的被翻譯的開放閱讀。

（3）核糖體翻譯進(jìn)行到哪個位置了。

（4）翻譯起始、延伸、終止不同階段的速率變化，以及翻譯在某個階段是否終止了。

… …

圖4 核糖體印記的特點(diǎn)

圖5 RNA-seq、RNC-seq和Ribo-seq的比較

（PLoS genetics, 2016, 12(2): e1005901）

如圖5，我們可以直觀比較mRNA-seq、RNC-seq和Ribo-seq實(shí)驗(yàn)的區(qū)別。其中，mRNA-seq和RNC-seq最為相似，都是測mRNA序列全長。不同的是，RNC-seq測的是與核糖體結(jié)合的正在翻譯的mRNA的全長。

但美中不足的是，RNC-seq精度是mRNA全長序列級別的，對于mRNA內(nèi)部的翻譯信息，我們則是無法獲知的。而Ribo-seq則是彌補(bǔ)了這個不足。由于Ribo-seq的精度是單密碼子級別的，因此Ribo-seq不僅可以獲得整個基因翻譯量的信息，可以從中進(jìn)一步獲知基因內(nèi)部翻譯變化的豐富信息。Ribo-seq相比RNC-seq的優(yōu)勢，如下表。

表1 RNC-seq和Ribo-seq的比較

要獲得Ribo-seq的這些優(yōu)勢，代價(jià)是實(shí)驗(yàn)難度被大大提高了。但這些優(yōu)勢在具體的研究中，還是非常有價(jià)值的。在9月20日，我們進(jìn)行了《翻譯組-連接mRNA與蛋白的橋梁（上）》的Omicshare class課程，我們提到基于Ribo-seq可以進(jìn)行三大分析（如圖6）。其中，“新可翻譯分子”和“翻譯調(diào)控”這兩個分析點(diǎn)，就是建立在Robi-seq單密碼子精度的基礎(chǔ)上，這是RNC-seq所無法達(dá)到的。

圖6 Ribo-seq的三大分析點(diǎn)

那么，Ribo-seq的三大分析點(diǎn)在實(shí)際研究中都有什么作用？三大分析點(diǎn)如何組合成一篇高分文章呢？是的，基于Ribo-seq的高分文章也是有套路的。我們樂于分享這些套路，讓對該技術(shù)感興趣的你，可以抓住Ribo-seq五花八門的分析內(nèi)容背后的核心規(guī)律。