(1)直接法雙重免疫熒光標記：

將標記有兩種不同熒光素的抗體(如抗A和抗B)以適當比例混合，滴加在標本上孵育，然后洗去未結合的熒光抗體，在熒光顯微鏡下分別選擇兩種相應的激發(fā)濾片觀察，即可對兩種抗原進行定位和定量。直接法簡便可靠，但靈敏度較低。

(2)間接法雙重免疫熒光標記：

用未標記的兩種特異性第一抗體孵育組織或細胞，洗去多余的第一抗體后，再用兩種不同的熒光素分別標記的第二抗體孵育組織或細胞，洗去多余的第二抗體，后在熒光顯微鏡下分別選擇兩種相應的激發(fā)濾片觀察，從而對兩種抗原進行定位和定量。使用此法應注意兩種特異性第一抗體必須來源于不同種屬，且熒光標記第二抗體的種屬必須與第一抗體的種屬相匹配。

實驗注意事項： 

1、熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察，或于4℃保存4h，時間過長，可能會使熒光提前衰退。

2、每次試驗均需設置以下三種對照：

(1) 陽性對照：陽性血清+熒光標記物;

(2) 陰性對照：陰性血清+熒光標記物;

(3) 熒光標記物對照：PBS+熒光標記物。

最后來說一說免疫熒光的經(jīng)驗之談！

1、合適的細胞密度

細胞密度是試驗成功的第一步，細胞密度太大，會造成細胞過于擁擠而邊界不清晰，不僅細胞形態(tài)不佳且易導致染色背景深。同理細胞過少時不僅容易貼壁不好觀察時不好找細胞，而且由于細胞過少可能活性不佳從而易發(fā)生非特異性熒光染色。不管是用六孔板還是共聚焦皿細胞密度以達到75%-85%最佳。

2、細胞固定和通透

固定劑的選擇依賴于抗原的亞細胞定位（膜蛋白，可溶，細胞骨架相關蛋白等）。3.7%-4%的甲醛或多聚甲醛是最常用的固定劑，適用于絕大多數(shù)蛋白。如果是研究膜蛋白的話，最好用3.7%-4%的甲醛。而研究細胞骨架成分可用甲醇固定法。固定后一般需要通透步驟，通透即是在膜上打孔，讓抗體更易進入細胞與抗原結合。選擇通透劑應充分考慮抗原蛋白的性質(zhì)。通透一般可以用0.1%-0.2%的Triton-X 100，而選擇甲醇固定一般無需再通透，甲醇本身就有通透的作用。

3、封閉條件的優(yōu)化選擇

為了防止內(nèi)源性非特異性蛋白抗原的結合，需要在一抗孵育前用封閉液封閉，這樣可以減少非特異性的背景著色。封閉液可以選擇二抗來源一致的血清，一般來說，血清價格比較昂貴，可以用1%-5%BSA替代，BSA可以說是萬能的封閉血清。另外封閉時間不易過長，30-60min即可，且封閉后不用洗滌，直接加一抗孵育即可。

4、一抗二抗的選擇

封閉過后需要一抗孵育，可以選擇4度過夜孵育或者室溫3h，以筆者的經(jīng)驗是一抗孵育4度過夜比較好，抗原抗體結合會比較充分。一抗二抗的稀釋比例可以根據(jù)抗體說明書來，再根據(jù)自己具體的實驗要求進行優(yōu)化。如果抗體濃度過低，會造成信號太弱，如果抗體濃度過高可能會造成背景染色太強。熒光二抗個人感覺Alex flour熒光基團信號強于Dylight強于FITC。如果做免疫雙標，一抗要來自不同種屬，熒光二抗的光譜也要分開。

5、洗滌步驟

免疫熒光過程中，有很多洗滌步驟，用PBS即可。在洗滌過程中，一要注意動作輕柔，固定后的細胞比較脆弱，如果太過大力，很容易把細胞吹洗掉，二是洗滌時間要把握好，每次洗滌5min左右，三是切忌不要干片，即吸掉溶液后不要把細胞干著，不然容易造成背景著色。