在qPCR實(shí)驗(yàn)過程中，合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，探針及引物的高質(zhì)量合成是其成功的關(guān)鍵。qPCR目前依然是核酸熒光定量檢測的常規(guī)實(shí)驗(yàn)，然而獲得信號(hào)特異、低背景的qPCR結(jié)果也非易事。從qPCR小白到大神，學(xué)習(xí)和摸索是少不了的。但是，君子生非異也，善假于物也，IDT PrimeTime^??系列產(chǎn)品，便是助您qPCR快速進(jìn)階的可“假”之“物”。

熒光探針是qPCR實(shí)驗(yàn)的核心，確定實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮?，首?dāng)其沖的是確定探針的類型，尤其是熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)。

圖1則是來源于IDT并在科研界廣為流傳的熒光基團(tuán)選擇表：根據(jù)qPCR儀支持的熒光通道選擇合適熒光基團(tuán)。

圖1. 常見qPCR儀適配的熒光基團(tuán)。

PrimeTime^?? qPCR系列探針涵蓋了常見熒光-淬滅組合，可根據(jù)圖2直接進(jìn)行選擇。請注意圖2中對熒光、淬滅基團(tuán)專利方面的相關(guān)備注，除了特殊備注外，大部分從IDT訂購熒光-淬滅組合均免專利許可費(fèi)。

圖2. IDT常見熒光淬滅基團(tuán)組

主要原因在于上述兩種淬滅基團(tuán)屬于某公司專利，其他公司若要進(jìn)行商用，需支付相應(yīng)的專利費(fèi)用（IDT也可提供BHQ系列淬滅基團(tuán)探針）。而與之相比，IDT自行開發(fā)的IBFQ（Iowa Black^?? FQ）和IBRQ（Iowa Black^?? RQ）淬滅基團(tuán)，其表現(xiàn)與BHQ系列類似，且無需任何專利費(fèi)用。

圖3. 不同熒光基團(tuán)的發(fā)射波長及淬滅基團(tuán)的選擇

ZEN^TM和TAO^TM 指在探針第9、10堿基之間添加的第二淬滅基團(tuán)。熒光基團(tuán)ZEN^TM-IBFQ / TAO^TM-IBRQ組合而成雙淬滅探針，可實(shí)現(xiàn)優(yōu)于BHQ的淬滅效果，而價(jià)格上比BHQ單淬滅基團(tuán)更低^[1]。

當(dāng)使用FAM熒光基團(tuán)與不同淬滅基團(tuán)：ZEN^TM-IBFQ、BHQ1、Eclipse^??、IBFQ和TAMRA組合的5’核酸酶探針進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)，背景和信號(hào)的熒光強(qiáng)度對比見圖4。雙淬滅探針以更低的背景和更高的熒光信號(hào)脫穎而出。

圖4. FAM搭配不同淬滅基團(tuán)背景與信號(hào)對比圖。在ABI 7900HT Real-Time PCR儀器上，對0.5 ng cDNA利用5種qPCR探針對ACTB基因進(jìn)行檢測。

IDT提供的雙淬滅探針作為5’核酸酶探針中的佼佼者，已成為越來越多高靈敏度檢測中的不二選擇。2017年9月Chao Shan等人發(fā)表在Nature Communication雜志的《針對3’UTR區(qū)域缺失的寨卡病毒基因組的單劑量減毒活疫苗可防止寨卡病毒的妊娠傳播和引起的睪丸損傷》研究中，在小鼠模型上使用IDT雙淬滅探針（ZENTM -IBFQ）進(jìn)行病毒載量的檢測，檢測下限可低至100拷貝/mL（圖5）^[2]。

圖5. 利用qRT-PCR 在不同免疫后時(shí)間點(diǎn)對病毒基因組的定量檢測。虛線代表檢測下限。（IDT雙淬滅探針FAM-/ZEN/-IBFQ）

IDT雙淬滅探針“加強(qiáng)不加價(jià)”，因此無論從功能還是成本上，我們都推薦大家使用雙淬滅探針。

關(guān)于雙淬滅探針更多的信息及應(yīng)用實(shí)例，可參考《兩道“消防線”，守住你的qPCR”》。

PrimeTime^?? 探針中還可以通過增加鎖核苷酸（LNA, Locked nucleic acid）來增加探針的Tm值，得到“短小精悍”的PrimeTime^?? LNA探針。

LNA相對結(jié)合親和力較強(qiáng)，一般來講LNA:LNA > LNA:DNA > DNA:DNA。LNA堿基的位置與序列有關(guān)，match和mismatch的?Tm一般＞15℃。因此，較短的PrimeTime^?? LNA探針擁有更好的淬滅效果，信噪比較低，提高了識(shí)別SNP的能力，常被應(yīng)用于一些難檢測的SNP和AT-rich區(qū)域的探針設(shè)計(jì)。

在設(shè)計(jì)方面我們建議如下：

2017年札幌東生物醫(yī)學(xué)研究所的Yusuke Ono等人在研究中，為了克服癌癥早期因cfDNA含量有限且KRAS突變頻率較低造成的早診瓶頸，在ddPCR平臺(tái)引入預(yù)擴(kuò)增步驟，并利用PrimeTime^??  LNA探針，在減少背景噪音的同時(shí)大幅度提高檢測KRAS突變的靈敏度（圖6）^[4]，使得cfDNA KRAS突變的檢測下限低至0.01%。

圖6. 使用ddPCR檢測突變KRAS探針的靈敏度和特異性。模板為攜帶已知KRAS突變的cfDNA，使用含有PrimeTime LNA探針，將突變和野生比例分別以10%，1%，0.1%，0.01%混合，證明該方法的檢測下限為0.01%。

最簡單的當(dāng)然是“拿來主義”，使用IDT的預(yù)設(shè)計(jì)！

IDT提供的PrimeTime^?? qPCR 預(yù)設(shè)計(jì)檢測包（Predesigned assay）包含一對引物和qPCR探針。這些預(yù)設(shè)計(jì)涵蓋了人、小鼠、大鼠的大部分基因，既從堿基組成、長度等方面優(yōu)化探針，還利用生信方法評估涉及的SNP位點(diǎn)（基于NCBI RefSeq數(shù)據(jù)庫），可有效避免非靶區(qū)域擴(kuò)增、剪切變異體和探針內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)。

值得一提的是，IDT對于常見信號(hào)通路的基因位點(diǎn)均提供預(yù)設(shè)計(jì)（圖7）。IDT承諾所有預(yù)設(shè)計(jì)擴(kuò)增效率達(dá)到90-110%，R²>0.99，若無法達(dá)到，則不收費(fèi)。

圖7. 常見信號(hào)通路基因位點(diǎn)表

若預(yù)設(shè)計(jì)庫中沒有您想挑選的“對象”，還可利用IDT在線工具PrimerQuest^?? tool，針對任意種屬的任意序列進(jìn)行在線設(shè)計(jì)。關(guān)于設(shè)計(jì)的諸多Assay如何進(jìn)行選擇，IDT在Tm、GC含量，檢測目標(biāo)位置和擴(kuò)增子長度等IDT已有詳細(xì)的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)供大家參考。

表1.  qPCR設(shè)計(jì)要點(diǎn)

有了引物和探針，最后不能忘了反應(yīng)環(huán)境！

PrimeTime^?? Gene Expression Master Mix 是IDT專利設(shè)計(jì)的2×預(yù)混型高效qPCR試劑，搭配Assay即可進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)，可保證擴(kuò)增效率高于90%。該混合液也適用于多重反應(yīng)，在標(biāo)準(zhǔn)和快速循環(huán)條件下均表現(xiàn)良好。另外，Master Mix不僅可以搭配PrimeTime^??系列探針，也完全兼容市面其他品牌的Probe-based qPCR實(shí)驗(yàn)。同樣，在應(yīng)用于商業(yè)或診斷時(shí)無需任何專利費(fèi)用。

Master Mix除包含有Hot-start Taq DNA 聚合酶、dNTP、MgCl2外（附送單獨(dú)包裝的參考染料），還含有特殊的增強(qiáng)劑和穩(wěn)定劑。因而其穩(wěn)定性堪稱Mix中的“Master Shifu”，即使經(jīng)歷長達(dá)7天50℃放置，仍具有高擴(kuò)增效率且Cq值穩(wěn)定（圖9）。

圖9. PrimeTime Gene Expression Master Mix 在50°C 長達(dá)7天獲得的一致性結(jié)果。該反應(yīng)配套使用 PrimeTime qPCR Predesigned Assay (ID: Hs.PT.58v.45621572)，50℃條件下分別選擇1，3，5和7天時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測。