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https://www./articles/s41388-018-0400-3

許多癌癥中可觀測(cè)到Notch信號(hào)通路的過(guò)度激活和細(xì)胞的缺氧應(yīng)激反應(yīng)。兩者的信號(hào)調(diào)節(jié)有交叉，目前普遍認(rèn)為缺氧信號(hào)可調(diào)節(jié)Notch信號(hào)，但不知道Notch信號(hào)是否可以調(diào)節(jié)缺氧信號(hào)。瑞典卡羅林斯卡學(xué)院的Mutvei等近日?qǐng)?bào)道了Notch信號(hào)可控制缺氧應(yīng)激的核心調(diào)控因子——HIF2α的表達(dá)，證實(shí)了Notch信號(hào)可以從這一節(jié)點(diǎn)調(diào)控癌細(xì)胞的缺氧應(yīng)激反應(yīng)，包括乳腺癌細(xì)胞、腎癌細(xì)胞、神經(jīng)管瘤細(xì)胞等。該研究近日發(fā)表在Oncogene上，可為未來(lái)的癌癥治療提供一些理論幫助。

細(xì)胞信號(hào)通路的失調(diào)與腫瘤形成緊密相關(guān)。Notch通路是多細(xì)胞生物中常見(jiàn)的、高度保守的、基于細(xì)胞間通訊的信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制。Notch接收器是橫跨細(xì)胞膜的跨膜蛋白，配體與其胞外結(jié)構(gòu)域的結(jié)合將激活Notch通路，引發(fā)Notch接收器被剪切和其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域 （Notch ICD）被釋放。Notch ICD隨后遷移至細(xì)胞核，與CSL（RBP-Jk）和MAML（Mastermind-like）蛋白結(jié)合成具有轉(zhuǎn)錄激活活性的三元結(jié)構(gòu)、誘導(dǎo)下游基因表達(dá)。

缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）是細(xì)胞缺氧應(yīng)激反應(yīng)的核心調(diào)控因子。在含氧量正常的情況下，對(duì)氧敏感的脯氨酰羥化酶將HIFα（包括HIF1α和HIF2α）維持在羥基化狀態(tài)，并通過(guò)E3泛素酶VHL的泛素化誘導(dǎo)蛋白酶體降解。HIF1α和HIF2α結(jié)構(gòu)相近，但功能稍有不同。前者更多地控制糖酵解相關(guān)基因，在神經(jīng)管細(xì)胞瘤中，HIF1α迅速積累且調(diào)控缺氧的急性應(yīng)激反應(yīng)。后者更多地調(diào)控與細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)的細(xì)胞間質(zhì)金屬蛋白酶，HIF2α在神經(jīng)細(xì)胞瘤中晚一些積累且調(diào)控缺氧的慢性應(yīng)激效應(yīng)。HIF1α可經(jīng)由信號(hào)開(kāi)關(guān)轉(zhuǎn)變?yōu)镠IF2α。

缺氧狀態(tài)下，Notch信號(hào)可被諸多機(jī)制上調(diào)，如HIF1α直接穩(wěn)固N(yùn)otch ICD、以及缺氧導(dǎo)致的Notch配體增加等。而卡羅林斯卡學(xué)院課題組的研究則證明了Notch反過(guò)來(lái)也可以調(diào)控缺氧應(yīng)激反應(yīng)，其機(jī)制與調(diào)控HIF2α表達(dá)有關(guān)；且同時(shí)說(shuō)明了Notch誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)需要HIF2α。他們的主要發(fā)現(xiàn)如下。

1.Notch在多種癌細(xì)胞中上調(diào)了HIF2α的mRNA水平

對(duì)比多個(gè)轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)，Notch信號(hào)激活時(shí)HIF2α的mRNA水平較高，而Notch信號(hào)封閉時(shí)較低。含氧量正常的條件下，在測(cè)試的9種培養(yǎng)的癌細(xì)胞系中，Notch信號(hào)的上調(diào)了8種的HIF2α mRNA表達(dá)。在利用人類乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231進(jìn)行的研究中，通過(guò)固定Notch的配體Jagged1或Dll4均可增加HIF2α的mRNA表達(dá)，而γ分泌酶DAPT可抑制這一作用。由此可見(jiàn)，Notch可誘導(dǎo)HIF2α 的mRNA表達(dá)，且這一作用的實(shí)現(xiàn)需要Notch ICD 的釋放。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，Notch的激活（配體激活或增加ICD表達(dá)）同樣上調(diào)了原代人癌細(xì)胞的HIF2α的mRNA水平。

缺氧條件下，通過(guò)Jagged1激活Notch也誘導(dǎo)了乳腺癌細(xì)胞系和原代人乳腺癌細(xì)胞中HIF2α的mRNA表達(dá)、且可被γ分泌酶DAPT抑制，這與含氧量正常條件下類似，Notch通過(guò)Notch ICD 的釋放誘導(dǎo)HIF2α mRNA表達(dá)。相反地，Notch信號(hào)不影響HIF1α的mRNA表達(dá)。而缺氧會(huì)導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞系中HIF1α的mRNA減少。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，HIF2α與Notch的配體Jagged1的表達(dá)在所有被分析的腫瘤類型中都顯著相關(guān)，包括腎癌、乳腺癌、乳導(dǎo)管癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤等。而HIF1α與Jagged1則不在任何腫瘤類型中顯著相關(guān)。

圖1 Notch信號(hào)激活了HIF2α的表達(dá)

2.Notch常規(guī)通路可調(diào)控HIF2α的表達(dá)，但卻并非通過(guò)HIF2α近端啟動(dòng)子

為明確HIF2α的激活是否需要Notch1 ICD遷移至細(xì)胞核，研究者們短暫表達(dá)了一個(gè)Notch1 ICD接收器和雌激素接收器的復(fù)合結(jié)構(gòu)NERT2。NERT2可在加入抗雌激素他莫昔芬的情況下從細(xì)胞質(zhì)遷移到細(xì)胞核。結(jié)果表明：在成神經(jīng)管細(xì)胞瘤和乳腺癌細(xì)胞系中，細(xì)胞質(zhì)中的NERT2表達(dá)不會(huì)促進(jìn)HIF2α及其下游標(biāo)志基因NRAPP的表達(dá)，但他莫昔芬誘導(dǎo)的NERT2遷移至細(xì)胞核可顯著上調(diào)兩者的表達(dá)。dnMAML的表達(dá)可拮抗他莫昔芬（通過(guò)NERT2）對(duì)HIF2α和NRAPP的上調(diào)作用，表明Notch的常規(guī)通路可對(duì)HIF2α實(shí)現(xiàn)調(diào)控。通過(guò)CRISPER/Cas9使CSL失活也減少了Notch對(duì)HIF2α的上調(diào)。

作者進(jìn)一步研究了Notch上調(diào)HIF2α的機(jī)理：是通過(guò)直接與HIF2α啟動(dòng)子結(jié)合，還是通過(guò)間接方式。染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序（ChIP-seq）發(fā)現(xiàn)，CSL在Notch激活時(shí)未與HIF2α啟動(dòng)子及基因結(jié)合，而是與HES1啟動(dòng)子上的一個(gè)常見(jiàn)位點(diǎn)結(jié)合。同樣地，在熒光素酶報(bào)告基因測(cè)驗(yàn)中，Notch的激活并不激活HIF2α啟動(dòng)子區(qū)。然而，采用蛋白翻譯抑制劑環(huán)己酰亞胺（CHX）來(lái)阻隔Notch激活時(shí)發(fā)現(xiàn)，CHX處理抑制了依賴于Notch激活的HIF2α表達(dá)，但Notch下游基因NRARP不受影響。而更生霉素(actinomycin D) 則同時(shí)抑制了Notch對(duì)HIF2α和NRARP的激活。上述結(jié)果表明， Notch ICD/CSL通過(guò)激活一個(gè)可上調(diào)HIF2α表達(dá)的中間蛋白來(lái)控制HIF2α，而非直接與HIF2α啟動(dòng)子結(jié)合。

圖2  常規(guī)Notch 通路可調(diào)控HIF2α表達(dá)，但并非通過(guò)直接的轉(zhuǎn)錄激活

3.上調(diào)的Notch信號(hào)提升了HIF2α蛋白水平，刺激了HIF1α向HIF2α轉(zhuǎn)換

含氧量正常的情況下，HIFα因子處于被降解的狀態(tài)。但基于激活Notch誘導(dǎo)了HIF2α 的mRNA表達(dá)，研究者們?cè)O(shè)想HIF2α的蛋白表達(dá)也會(huì)增加。在乳腺癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤和VHL缺陷腎癌細(xì)胞系中的試驗(yàn)證實(shí)，含氧量正常的情況下，異常的Notch1 ICD 表達(dá)會(huì)導(dǎo)致Notch信號(hào)的高度激活，從而提升HIF2α蛋白水平。Notch激活HIF2α的活性在其同源蛋白中高度保守：Notch2和Notch3也對(duì)HIF2α有上調(diào)作用。

配體調(diào)控的Notch激活相對(duì)緩和。含氧量正常的情況下，24小時(shí)配體激活可增加培養(yǎng)的人乳腺癌細(xì)胞中的HIF2α蛋白含量，但72小時(shí)處理無(wú)效；并且也對(duì)原代人乳腺癌細(xì)胞無(wú)效。而缺氧條件下，培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞和原代人乳腺癌細(xì)胞中均能觀測(cè)到配體誘導(dǎo)的HIF2α蛋白含量增加。在乳導(dǎo)管癌和髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞中，通過(guò)二氯化鈷模擬缺氧環(huán)境也能觀測(cè)到類似結(jié)果。

不論是否缺氧，Notch激活導(dǎo)致多種癌細(xì)胞中HIF1α蛋白水平下降，包括乳導(dǎo)管癌細(xì)胞和原代乳腺癌細(xì)胞。上述現(xiàn)象在較長(zhǎng)的處理時(shí)間才能觀測(cè)到，說(shuō)明Notch誘發(fā)的HIF1α向HIF2α轉(zhuǎn)變需要一定時(shí)間。在一系列控制HIF1α向HIF2α轉(zhuǎn)變的開(kāi)關(guān)蛋白中，編碼HIF1α降解相關(guān)泛素連接酶的CHIP蛋白被Jagged1輕微上調(diào)、并被DAPT顯著下調(diào)，由此推測(cè)CHIP是Notch和HIF1α之間的信號(hào)中介。

圖3 Notch 信號(hào)增加了HIF2α蛋白表達(dá)，及HIF1α向HIF2α轉(zhuǎn)換

4.Notch誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄組中的部分mRNA依賴于HIF2α表達(dá)

HIF2α是轉(zhuǎn)錄因子，研究者們認(rèn)為Notch誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄組應(yīng)該包括Notch ICD 和HIF2α 共同激活的目標(biāo)。為找出HIF2α特異的基因，研究者們先測(cè)試了與缺氧和HIF2α相關(guān)的兩個(gè)基因VEGF和AREG，二者均可被Notch上調(diào)且上調(diào)作用可被DAPT拮抗。

為宏觀評(píng)估HIF2α對(duì)基因表達(dá)的影響，研究者們通過(guò)他莫昔芬在穩(wěn)定表達(dá)NERT2的癌細(xì)胞中激活了Notch1信號(hào)，并通過(guò)siRNA對(duì)HIF2α及HIF1α進(jìn)行基因敲減?；蚪M范圍的RNA測(cè)序結(jié)果表明： 激活Notch在含氧量正常的情況下上調(diào)了1062個(gè)基因，在缺氧條件下上調(diào)了881個(gè)基因；在缺氧和非缺氧條件下都被Notch上調(diào)的基因有547個(gè)。含氧量正常的情況下，HIF2α siRNA的敲減作用下調(diào)了1062個(gè)基因中的227個(gè)基因（約21%），而HIF1α siRNA的敲減作用僅下調(diào)了44個(gè)Notch激活的基因（約4.1%）。約4.7%的基因同時(shí)被HIF1α和HIF2α調(diào)控。功能注釋基因本體的富集分析顯示， Notch激活且依賴于HIF2α的這227個(gè)基因與惡性腫瘤形成過(guò)程中涉及的機(jī)制——如細(xì)胞黏著、血管增生和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等密切相關(guān)。

qPCR證實(shí)了上述基因中的三個(gè)代表——Notch3、TGFB2和ID3在含氧量正常的情況下誘導(dǎo)Notch表達(dá)，HIF2α siRNA可拮抗這一反應(yīng)。類似地，在HIF2α 被敲除的細(xì)胞中，他莫昔芬激活Notch1 ICD 無(wú)法再上調(diào)TGFB2和ID3的表達(dá)；且相對(duì)于siRNA敲減HIF2α的模型，Notch3的上調(diào)也顯著減少。

圖4 Notch誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄組中的部分目標(biāo)表達(dá)依賴于HIF2α。

5.Notch同源接收器在成神經(jīng)管細(xì)胞瘤生長(zhǎng)中的特異效應(yīng)。

研究者們測(cè)試了Notch和HIF2α信號(hào)變異對(duì)髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞形成腫瘤能力的影響。尿囊膜移植模型表明 Notch2 ICD 、而非Notch1 ICD促進(jìn)了腫瘤生長(zhǎng)。采用CRISPER/Cas9抑制Notch1或Notch2而分別制造的癌細(xì)胞系中，抑制Notch1的癌細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞系相近，而抑制Notch2的癌細(xì)胞生長(zhǎng)顯著減少。轉(zhuǎn)錄組分析表明166個(gè)基因在抑制Notch1及抑制Notch2的兩種癌細(xì)胞系中均上調(diào)，541個(gè)基因僅在抑制Notch2的癌細(xì)胞中上調(diào)，349個(gè)基因僅在抑制Notch1的癌細(xì)胞中上調(diào)。195個(gè)基因在上述兩種癌細(xì)胞系中均下調(diào)，270個(gè)基因在抑制Notch2癌細(xì)胞系中特異性下調(diào)，825個(gè)基因在抑制Notch1癌細(xì)胞系中下調(diào)。

在NERT2表達(dá)的髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞的HIF2α陽(yáng)性或HIF2α陰性細(xì)胞中，他莫昔芬誘導(dǎo)的Notch1 ICD增加特異性抑制了HIF2α陰性癌細(xì)胞的快速生長(zhǎng)，但不影響HIF2α陽(yáng)性癌細(xì)胞的生長(zhǎng)（僅上調(diào)NOTCH3和HEY）。Notch1而非Notch2缺陷會(huì)導(dǎo)致大量基因異常，表明存在Notch1特異的生長(zhǎng)抑制基因，且它們僅在HIF2α缺乏時(shí)發(fā)揮作用。

此外，在缺氧條件下，HIF2α陰性細(xì)胞中HIF1α蛋白水平較高，采用HIF1α抑制劑KC7F2減少了對(duì)照及Notch1 ICD激活組中的腫瘤生長(zhǎng)。上述試驗(yàn)同樣證明了HIF2α導(dǎo)致HIF1α增加。