什么是引物的特異性

引物是一段短的單鏈寡核苷酸，在PCR過程的退火階段，引物與單鏈模板結(jié)合，DNA聚合酶沿著引物的3末端向后進行DNA的合成。引物與模板的結(jié)合遵循堿基互補配對的原則，因此，當退火溫度不合適或引物設計不合理時，引物會結(jié)合到模板的非目標區(qū)域，從而導致其他片段的擴增。

所謂引物特異性，就是引物結(jié)合模板正確位置的能力，或者避免結(jié)合非目標位置的能力。引物的長度、GC含量、堿基分布、Tm值等性質(zhì)，均會影響其特異性。

Primer-Blast比對引物特異性的原理

NCBI收錄了諸多物種的基因組DNA、編碼序列mRNA以及其他相關核酸序列的數(shù)據(jù)。使用Primer-Blast進行比對，首先要輸入一對引物序列，并選擇序列所屬數(shù)據(jù)庫。此時系統(tǒng)將在該數(shù)據(jù)庫中對序列進行查找和對比，并將引物可能結(jié)合的位置進行記錄，一旦結(jié)合位置處于兩條鏈并且產(chǎn)物大小符合要求，系統(tǒng)就會將這種情況列舉到結(jié)果中。需要注意的是，結(jié)合模板的引物不僅是一條正向一條反向，也有可能是兩條正向或者兩條反向引物。

Primer-Blast比對引物特異性的步驟

打開NCBI，進入Blast，網(wǎng)頁如下：

點擊上圖紅框標記的Primer-Blast，進入如下界面，在界面引物序列處，將正反向引物序列粘貼進去，5-3方向。產(chǎn)物大小默認為70~1000，可以根據(jù)實際情況進行調(diào)整。

選擇相應的物種和參考數(shù)據(jù)庫。

物種：人源的基因選擇Homo sapiens(taxid:9606)；小鼠的選擇Mus musculus (taxid:10090)；大鼠的選擇Rattus norvegicus(taxid:10116)。

參考數(shù)據(jù)庫：要看PCR的模板是什么，如果是提取的RNA反轉(zhuǎn)錄后得到cDNA就選擇Refseq mRNA（針對mRNA）或Refseq RNA（針對mRNA和lncRNA）；若模板是基因組，則應該選擇Refseq representative genomes。在Exclusion行中，可以對預測的序列以及環(huán)境/不可培養(yǎng)樣本序列的干擾。

選好數(shù)據(jù)庫和物種后點擊頁面左下角的Get Primers，系統(tǒng)進行分析，一段時間后會進入如下頁面：（該頁面以一對人EGFR的qPCR引物為例）

上圖顯示了多個結(jié)果，原因是EGFR基因有多個轉(zhuǎn)錄變體，這對引物能夠?qū)⑾路斤@示出來的變體都檢測到。

每個結(jié)果分為多個部分：

第一部分為比對出來的基因結(jié)果；對于mRNA數(shù)據(jù)庫，提供了該mRNA的NM號，對于基因組數(shù)據(jù)庫，則會顯示出基因組編號，點進去會出現(xiàn)預測的產(chǎn)物序列。

第二部分為預測出來的產(chǎn)物大小。

第三部分為正反向引物和模板的結(jié)合形式，“點”代表該位置的序列和模板完全互補配對。

非特異性結(jié)果如下：

如上圖，紅框位置并非是“點”，而是堿基，說明該位置跟模板不匹配，這種屬于潛在的非特異性擴增結(jié)果。

對于非特異性結(jié)果的判斷

對于常規(guī)PCR，產(chǎn)物可以通過凝膠電泳對非特異性條帶進行分離，引物的非特異性并不是很重要，但是對于SYBR Green染料法熒光定量PCR，引物的特異性則非常重要。

但是，并不是說預測出了非特異結(jié)果，引物的性質(zhì)就一定不好，需要具體情況具體對待：

首先，引物的3端對擴增效率的影響是非常大的，如果預測出的非特異性結(jié)果中，3端存在不匹配堿基，說明即使引物能夠結(jié)合模板，但3端會翹起，導致無法擴增，這一類的非特異結(jié)果可以忽略。

其次，PCR的產(chǎn)物大小是有限制的，尤其對于qPCR，由于延伸時間非常有限，大于1000的產(chǎn)物是基本上無法擴增出來的，如果非特異性產(chǎn)物遠大于目的產(chǎn)物大小，這種非特異性結(jié)果也是可以忽略的。

Primer-Blast比對引物特異性的意義

當然，任何引物工具或者軟件，都是根據(jù)一定的參數(shù)和算法進行的預測，結(jié)果只是起到了參考、建議的作用，并不能代表該引物的實際使用情況。

特性好的引物在實際使用過程中不一定表現(xiàn)優(yōu)秀，反之預測特性不好的引物也不一定不能使用。一對引物究竟好不好用，最終還是要通過實際實驗來驗證的。也正是因為如此，生工生物免費引物設計服務是默認不經(jīng)過Primer-Blast的。

但也不是說Primer-Blast一點實際意義沒有，比如在上述EGFR案例，可以準確判斷一對引物是否能夠?qū)⒃摶虻乃修D(zhuǎn)錄變體覆蓋到。NCBI的引物設計工具憑借基因序列直達引物設計的入口、其豐富的設置選項、特異性預測的功能還是得到了廣大科研工作者的青睞，熟悉掌握了該工具，將為您的分子生物學實驗起到很大幫助。