本期特邀專家為中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院蔡修宇教授，進(jìn)行專家點(diǎn)評(píng)。醫(yī)統(tǒng)江湖團(tuán)隊(duì)期待更多的臨床專家加入，一起來給大牌研究找找茬

統(tǒng)計(jì)師：莫淼

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院

統(tǒng)計(jì)師

Nivolumab plus Ipilimumab in Lung Cancer

with a High Tumor Mutational Burden

本期分享的是2018年4月發(fā)表在新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志上的Checkmate227研究：Nivo+Ipi免疫聯(lián)合治療高腫瘤突變負(fù)荷(TMB)的NSCLC患者。

關(guān)于晚期NSCLC的綜合治療，根據(jù)不同的分子標(biāo)志物、采用不同的治療方式聯(lián)合，患者生存期可以得到不同程度的延長(zhǎng)。關(guān)于晚期NSCLC的免疫治療研究，存在明顯的前移趨勢(shì)，由后線治療逐步轉(zhuǎn)向一線治療。

以上研究都是將免疫治療作為晚期NSCLC一線治療，治療策略各有不同。其中獲得陽性結(jié)果的，Keynote024采用的是Pembrolizumab單藥；Keynote189是Pembrolizumab+化療；Impower150則是Atezolizumab+Bev+化療。

近期免疫治療十分熱門，其中也存在很多問題需要進(jìn)一步探索。首先，免疫治療的總體反應(yīng)率較低，在未經(jīng)篩選的全人群中，反應(yīng)率約為20%。而免疫治療一旦產(chǎn)生反應(yīng)，則療效持久。許多研究仍在尋找有效的療效預(yù)測(cè)因子，來篩選出能從免疫治療中獲益更多的患者群體。

目前臨床將PD-L1表達(dá)情況作為療效預(yù)測(cè)因子，但PD-L1高/低的判斷界值在各研究中不盡相同：1%，5%，50%都有。例如，Keynote024采用50%為界值，將大批患者排除在外。此外，PD-L1表達(dá)水平在治療中存在動(dòng)態(tài)變化，給監(jiān)測(cè)及評(píng)估帶來了一定難度。其他預(yù)測(cè)標(biāo)志物也在研究中，例如腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞：“冷腫瘤”/“熱腫瘤“；腸道微生物組；腫瘤突變負(fù)荷：測(cè)序技術(shù)的普及和優(yōu)化；腫瘤新抗原。

鑒于一線免疫單藥治療人群存在高度選擇性，如何把免疫治療推到應(yīng)用到更廣泛人群，使他們得到更大獲益呢？綜合多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，免疫治療在聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，療效似乎不受PD-L1表達(dá)高低的影響；是否可能存在其他標(biāo)志物可用來預(yù)測(cè)免疫聯(lián)合治療療效？這是免疫聯(lián)合治療的一個(gè)重要方向。

CheckMate227研究正是針對(duì)雙重免疫聯(lián)合治療，其中納武單抗是PD-1通路抑制劑，伊匹木單抗是CTLA-4/B7通路抑制劑，這兩條通路作用于免疫激活不同的條件，可產(chǎn)生協(xié)同作用。

前期的I期研究（CheckMate012），對(duì)該雙免疫聯(lián)合治療方案的最佳劑量進(jìn)行了探索。左邊的三種劑量探索是參考黑色素瘤以及腎癌的研究中的劑量。研究者發(fā)現(xiàn)，在這些劑量下免疫聯(lián)合免疫會(huì)出現(xiàn)毒性大、耐受性差的情況。因此，研究者開始探索右側(cè)的劑量組合。首先，Nivo 1mg/kg聯(lián)合Ipi，由于降低了Nivo劑量，會(huì)導(dǎo)致ORR降低。于是研究者將Nivo劑量提高到3mg/kg，觀察到了較好的療效。如何聯(lián)合Ipi呢？研究者發(fā)現(xiàn)，Ipi劑量增加時(shí)，療效可能更好。因此，基于該項(xiàng)I期研究結(jié)果，CheckMate227研究選擇了Nivo3mg/kg Q2W + Ipi 1mg/kg Q6W的劑量方案，探索免疫聯(lián)合免疫的治療策略在NSCLC患者中的療效，它是一項(xiàng)隨機(jī)化、開放標(biāo)簽、多中心的III期臨床研究。

回顧前一期關(guān)于Keynote189研究的解讀，在非鱗NSCLC一線治療中免疫（Pembrolizumab）聯(lián)合化療vs化療，呈現(xiàn)出較理想的結(jié)果。同時(shí)也留下一個(gè)問題：免疫聯(lián)合化療vs免疫單藥，效果如何？本期解讀的CheckMate227研究就包含了這一話題，它相當(dāng)于在Keynote189基礎(chǔ)上增加了更多比較類型，整體上涉及免疫聯(lián)合免疫、免疫聯(lián)合化療、免疫單藥、化療（雙藥）四種策略之間的比較。本次解讀主要針對(duì)目前已公布的免疫聯(lián)合免疫vs化療的結(jié)果，即整體設(shè)計(jì)中的1a和1b的一部分，暫不涉及與Keynote189設(shè)計(jì)相似的part2。

根據(jù)本研究Protocol中公開的信息，最初的研究設(shè)計(jì)并不是這樣。首先來看一下初始研究方案（2015.05.29）。

最初設(shè)計(jì)是將患者按照PD-L1表達(dá)情況（表達(dá)或不表達(dá)）分兩個(gè)隊(duì)列，相當(dāng)于兩個(gè)獨(dú)立的RCT，α分別設(shè)為0.05，分別進(jìn)行隨機(jī)化分配至不完全相同的3個(gè)治療組。在PD-L1表達(dá)陽性的人群中，治療組分別是：Nivo單藥；Nivo+Ipi聯(lián)合；單純化療。在PD-L1不表達(dá)的人群中，治療組分別是：Nivo+Ipi聯(lián)合治療；雙免疫聯(lián)合4療程后改Nivo單藥維持；單純化療。樣本量按1:1設(shè)計(jì)，兩個(gè)隊(duì)列分別是990例，預(yù)期需篩選2475。初始方案的研究終點(diǎn)設(shè)計(jì)如下：

本研究先后經(jīng)過了4次重要的方案調(diào)整。最大的調(diào)整在于，第1次去掉E組、增加G組即免疫聯(lián)合化療組，第4次引入TMB并相應(yīng)調(diào)整研究目標(biāo)、統(tǒng)計(jì)分析計(jì)劃、研究終點(diǎn)等。另外根據(jù)第4版protocol相比第1版的內(nèi)容變化推測(cè)，期間增加了關(guān)于Part2的設(shè)計(jì)，并將整個(gè)研究區(qū)分1a、1b和2三個(gè)部分。

Protocol中關(guān)于每次調(diào)整的原始描述如下，部分信息暫時(shí)未公開。

因此，經(jīng)歷4次主要調(diào)整后，當(dāng)前研究設(shè)計(jì)Part1如下（Part2暫未公開）：

調(diào)整后的CheckMate227 Part1研究設(shè)計(jì)概況如下。2015年8月開始入組，2016年11月入組結(jié)束（也就是說，2017年引入TMB時(shí)患者入組已結(jié)束），數(shù)據(jù)鎖定在2018年1月，初步結(jié)果在今年4月16日發(fā)表。

調(diào)整后的研究終點(diǎn)如下。主要研究終點(diǎn)分包含2部分：一是基于TMB選擇人群（TMB≥10）雙免疫聯(lián)合vs化療的PFS結(jié)果（獨(dú)立委員會(huì)評(píng)估）比較，一是基于PD-L1選擇人群雙免疫聯(lián)合vs化療的OS結(jié)果比較。 

Protocol顯示，基于TMB選擇人群設(shè)有1個(gè)主要研究終點(diǎn)、3個(gè)次要研究終點(diǎn)，并且根據(jù)Hierarchical原則按一定次序進(jìn)行檢驗(yàn)。主要研究終點(diǎn)α=0.05/2=0.025（圖示有誤）。第1個(gè)次要研究終點(diǎn)是免疫單藥vs化療的PFS結(jié)果，另外2個(gè)次要終點(diǎn)是對(duì)應(yīng)前述2個(gè)人群和比較類型相應(yīng)的OS結(jié)果。這樣的檢驗(yàn)次序的確定，可能主要是考慮OS數(shù)據(jù)收集要晚于PFS，并沒有提供PFS比OS更容易出現(xiàn)陽性結(jié)果的明確依據(jù)。而文中僅提及研究終點(diǎn)2、3，未提及4。并且目前只報(bào)道了1、2，尚未報(bào)道OS結(jié)果。

本次報(bào)道結(jié)果主要是基于Part1兩個(gè)主要研究終點(diǎn)中的第1個(gè)，即基于TMB水平選擇人群的分析。那么，針對(duì)經(jīng)選擇人群的分析，樣本量是否依然足夠？研究者對(duì)此進(jìn)行了事后的樣本量驗(yàn)證，預(yù)期高TMB人群雙免疫聯(lián)合治療對(duì)比化療HR為0.66（中位PFS從6m提高至9.1m），所需樣至少為265人，而實(shí)際納入符合該分析條件的患者有299人。

對(duì)于這樣事后的樣本量估計(jì)，其實(shí)存在一定的風(fēng)險(xiǎn)。換句話來說，可以認(rèn)為是沒什么懸念，因?yàn)橹灰?/span>HR設(shè)定為合適的某個(gè)值，總能計(jì)算出一個(gè)小于實(shí)際人數(shù)的“所需樣本量”。因此，事后估計(jì)受人為因素影響較大，存在一定的數(shù)字游戲風(fēng)險(xiǎn)。

下面談?wù)劚狙芯恐饕剿鞯?/span>療效預(yù)測(cè)標(biāo)志物：腫瘤突變負(fù)荷，是指在腫瘤細(xì)胞基因組中評(píng)估基因的編碼區(qū)發(fā)生體細(xì)胞突變（堿基置換、插入/缺失）的數(shù)目，計(jì)算的方法是去除胚系突變后每兆堿基（Megabase）中的突變數(shù)目。最開始的評(píng)估技術(shù)是采取WES：21,522 genes-coding regions，較為耗時(shí)，不適用于臨床實(shí)踐。本研究中采取了改良的方法：FoundationOne CDx。它是FDA批準(zhǔn)的腫瘤個(gè)體化治療的基因工具，采用324個(gè)基因panel做基因測(cè)序（NGS），用以分析TMB。NGS方法檢測(cè)時(shí)間較短，適合臨床應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，WES和NGS檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性良好，NGS可以很好地替代WES在臨床應(yīng)用。

那么，界定高TMB水平的Cutoff值是如何選擇的呢？首先，選擇TMB≥ 10Mut/Mb主要是基于CheckMate568研究結(jié)果，也是Nivolumab+Ipilimumab一線治療NSCLC的II期研究。從ROC曲線圖可以看出TMB大小和ORR的關(guān)系在9-10附近表現(xiàn)最佳，對(duì)應(yīng)曲線下面積為0.73。從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度來看，這只是一個(gè)剛剛滿足顯著差異標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)果，并不是非常顯著的差異性區(qū)分結(jié)果。從臨床角度來看，TMB≥10與TMB<>同為雙免疫聯(lián)合，本研究依據(jù)該結(jié)果選擇10Mut/Mb作為主要界值。

次要研究終點(diǎn)中，Nivo單藥對(duì)比化療的部分選擇了13Mut/Mb作為界值，則是參考CheckMate026研究關(guān)于TMB的回顧性分析結(jié)果，顯示高TMB人群中Nivo單藥對(duì)比化療具有明顯優(yōu)勢(shì)。并且這項(xiàng)回顧性分析將TMB水平與PD-L1表達(dá)狀態(tài)進(jìn)行綜合分層，在PD-L1表達(dá)低的人群中，如果TMB高的話，也更容易從Nivo中獲益。而如果兩者都高，則是獲益最好的亞組。 

上圖是針對(duì)Part1的患者入組情況以及基于TMB選擇的人群結(jié)果?？偣埠Y選2877例患者，排除標(biāo)準(zhǔn)包括已知EGFR、ALK突變；自身免疫性疾??；未治療的CNS轉(zhuǎn)移等。納入隨機(jī)的患者1739例，包括兩個(gè)隊(duì)列：PD-L1≥1%，N=1189；PD-L1<>，N=550。分別以組織學(xué)類型作為分層因素，按1：1：1隨機(jī)分配至3個(gè)治療組。

對(duì)所有入組患者回顧性進(jìn)行TMB檢測(cè)，1739例患者中TMB可評(píng)估的1649例，占94.8%；經(jīng)評(píng)估后可得到可靠TMB結(jié)果的1004例，占總?cè)巳旱?/span>57.7%。其中，TMB≥10 mut/Mb的總共444例，占可評(píng)估人群的44.2%，包括雙免疫聯(lián)合治療組139例與單純化療組160例。因此，若高TMB確實(shí)是有效的療效預(yù)測(cè)因素，預(yù)計(jì)約40%的可評(píng)估患者能從中獲益，但不是每個(gè)人都滿足評(píng)估條件。

本研究探索了TMB與PD-L1表達(dá)的關(guān)系，從圖中可以看出，TMB與PD-L1不存在明顯的相關(guān)關(guān)系，可能是與PD-L1無關(guān)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素，為二者聯(lián)合預(yù)測(cè)療效的思路提供了依據(jù)和基礎(chǔ)。

研究附件中展示了全部患者人群與高TMB選擇人群在各個(gè)治療組之間的基線情況比較，但目前只公布了除免疫聯(lián)合化療組以外的三個(gè)治療組的情況，基線分布是相似的。

對(duì)于高TMB患者，雖然沒有針對(duì)該亞組進(jìn)行前瞻性隨機(jī)分組，其基線特征分布在雙免疫治療組與化療組之間較為均衡。

關(guān)于治療完成情況，免疫治療并未對(duì)治療時(shí)間作限定，若研究者認(rèn)為患者可以從免疫治療中持續(xù)獲益，那么免疫治療可以一直繼續(xù)下去，前提是不發(fā)生嚴(yán)重的毒性反應(yīng)。可以看到，在雙免疫治療組中，繼續(xù)原治療方案的比例很高，高于化療組。同時(shí)，毒性反應(yīng)在雙免疫治療組中也有所升高。當(dāng)化療組的病人已經(jīng)完成所需化療時(shí)長(zhǎng)，可以不再繼續(xù)化療；非鱗NSCLC患者可在雙藥聯(lián)合化療一定療程后只采用培美曲塞單藥維持治療。 

關(guān)于進(jìn)展后治療情況，高TMB患者中，化療組30%接受了后續(xù)免疫治療，存在類似crossover的影響，但并不是crossover到研究組，因?yàn)檫€存在免疫單藥與雙免疫聯(lián)合的區(qū)別，且一部分患者使用了其他免疫藥物，如Pembro等。

基于高TMB患者的主要研究終點(diǎn)是比較雙免疫治療組對(duì)比化療組的PFS療效：mPFS和1y-PFS。1). ITT人群：1y-PFS: 30.9 vs 17.0% (HR=0.83, 95%CI: 0.72-0.96)；mPFS: 4.9 vs 5.5m，mPFS沒有達(dá)到顯著差異。從生存曲線來看，前期趨近于重合，后期曲線逐漸分開，這是由于免疫治療發(fā)揮療效一般需要較長(zhǎng)時(shí)間，而一旦發(fā)揮作用以后持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)。2). TMB 可評(píng)估人群：呈現(xiàn)出與ITT人群相似的趨勢(shì)，1y-PFS: 32.1 vs 15.2% (HR=0.83, 95%CI: 0.68-0.99)；mPFS: 4.9 vs 5.5m。3). 高TMB人群：兩個(gè)指標(biāo)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，1y-PFS: 42.6 vs  13.2% (HR=0.58, 95%CI: 0.41-0.81)；mPFS: 7.2 vs 5.5m (p<>。4). 低TMB人群：兩個(gè)指標(biāo)均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，1y-PFS: 25 vs  17% (HR=1.07, 95%CI: 0.84-1.35)；mPFS: 3.2 vs 5.5m (NS)。

高TMB患者中，次要研究終點(diǎn)ORR與DoR，雙免疫聯(lián)合治療組均表現(xiàn)出顯著優(yōu)于化療組的療效：前者總反應(yīng)率更高，且反應(yīng)持續(xù)1年以上的患者比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于化療組。

研究者針對(duì)PD-L1表達(dá)狀態(tài)進(jìn)行了亞組分析，分別在高TMB、PD-L1高表達(dá)與高TMB、PD-L1低表達(dá)患者中，比較雙免疫治療組和化療組的療效差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)亞組中1y-PFS均存在顯著差異，即高TMB患者不論PD-L1表達(dá)狀態(tài)，PFS均能從雙免疫聯(lián)合治療獲益。

此外，研究者還針對(duì)組織學(xué)類型進(jìn)行了亞組分析，認(rèn)為高TMB患者中，無論鱗癌、非鱗癌均存在雙免疫治療的PFS獲益。但從圖上可以看到，鱗癌患者的HR值95%CI是包含1的，只能得到存在獲益趨勢(shì)的結(jié)果。主要受前期生存曲線交叉的影響，后期存在較明顯的分離趨勢(shì)。 

其他亞組分析結(jié)果可見，大部分亞組均呈現(xiàn)雙免疫聯(lián)合治療獲益的趨勢(shì)。

關(guān)于次要研究終點(diǎn)Nivo單藥對(duì)比化療的PFS結(jié)果，分析人群為高TMB（界定為≥13 Mut/Mb）且PD-L1≥1%的患者，其PFS結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

此外，研究者還展示了高TMB（≥10 Mut/Mb）且PD-L1陽性患者3個(gè)治療組的PFS比較結(jié)果：Nivo+Ipi組對(duì)比化療組具有明顯的PFS獲益（同前PD-L1亞組分析結(jié)果）；Nivo+Ipi組對(duì)比Nivo單藥組療效較好，但其差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

安全性方面，總體的不良反應(yīng)情況在兩組間類似，但因不良反應(yīng)停藥的患者在雙免疫治療組相比化療組多了一倍。

而免疫雙藥與單藥相比，雙藥毒性略大?？偘l(fā)生率以皮膚反應(yīng)較高：33.9 vs 20.7%；3-4級(jí)不良反應(yīng)發(fā)生率以肝功能異常為最高：8.0 vs3.3%。

治療相關(guān)性死亡在兩組間均有發(fā)生。Nivo+Ipi組：1.2%（7人），其中3人肺炎，1人心包炎，1人急性腎小管壞死，1人循環(huán)衰竭，1人心包填塞?；熃M：1.1%（6人），其中2人膿毒癥，1人多發(fā)腦梗死，1人間質(zhì)性肺炎，1人血小板減少，1人惡性高熱伴膿毒癥。

本研究主要結(jié)論如下：具有高TMB的NSCLC患者一線應(yīng)用Nivo+Ipi聯(lián)合免疫治療對(duì)比化療，PFS顯著獲益，且無論PD-L1表達(dá)狀態(tài)如何；確立了Nivo+Ipi對(duì)NSCLC患者的獲益價(jià)值；為以TMB作為療效預(yù)測(cè)標(biāo)志物篩選目標(biāo)人群的后續(xù)研究提供了依據(jù)。

根據(jù)目前公布的數(shù)據(jù)，值得注意的是，本研究的TMB檢測(cè)均為事后檢測(cè)，在治療組間無法保證其他基線因素恰好均衡，因此，基于高TMB人群的這部分結(jié)果并不是真正意義上的RCT，仍有待更多前瞻性研究驗(yàn)證。此外，鱗癌亞組結(jié)果存在差異趨勢(shì)，但沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著，從KM曲線來看，主要受早期PFS存在交叉的影響，期待OS結(jié)果。

回顧一下梁斐統(tǒng)計(jì)師總結(jié)出的腫瘤免疫治療研究中PFS與OS之間的關(guān)系：

免疫治療如此熱門，關(guān)于免疫治療反應(yīng)的評(píng)估以及與傳統(tǒng)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)的差異也是研究者關(guān)心的熱點(diǎn)，尤其是關(guān)于“假性進(jìn)展”現(xiàn)象。免疫治療過程中，部分由傳統(tǒng)療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)為進(jìn)展的患者，繼續(xù)免疫治療后可顯現(xiàn)出OR或SD，發(fā)生率約為10%。主要原因是腫瘤內(nèi)部發(fā)生炎癥反應(yīng)使得腫瘤體積增大/出現(xiàn)可見的其他小病灶；隨著炎癥反應(yīng)的消退及腫瘤組織的退縮，逐漸顯現(xiàn)出臨床改善。某些患者中腫瘤生長(zhǎng)的速度會(huì)快于腫瘤免疫反應(yīng)發(fā)生的速度；經(jīng)過足夠時(shí)間后，免疫反應(yīng)占優(yōu)勢(shì)，臨床改善愈發(fā)明顯。本研究中，免疫治療的患者經(jīng)RECIST 1.1標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)為疾病進(jìn)展時(shí)，若認(rèn)為有臨床獲益且患者可耐受，可繼續(xù)原方案治療。

總結(jié)和比較目前的NSCLC一線免疫治療策略：Keynote 024和Checkmate 026都是單藥免疫治療對(duì)比化療，差異主要在于PD-L1界值的選擇，將界值提高到>50%可以看到mPFS、ORR、OS的顯著獲益。因此，Pembro獲批用于NSCLC滿足PD-L1>50%的患者的一線治療。但是，PD-L1>50%的患者在臨床上比例較少，對(duì)整體人群獲益有限。如何突破PD-L1界值的限制，讓更多患者受益？研究者們開始探索各種聯(lián)合治療的策略，例如Keynote189，Pembro+化療 vs. 化療，結(jié)果是不論PD-L1表達(dá)水平如何均有獲益。本研究Checkmate 227也嘗試突破PD-L1界值的限制，其中針對(duì)PD-L1<>：Nivo+Ipi vs. Nivo+化療 vs. 僅化療，試圖一次解決三組策略的比較，并加入TMB進(jìn)行療效預(yù)測(cè)價(jià)值的研究，期待后續(xù)OS結(jié)果。

因此，肺癌免疫治療領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展方向可能主要在于：多種聯(lián)合治療策略如何選擇？免疫聯(lián)合免疫 vs 免疫聯(lián)合化療二者比較又將如何？免疫聯(lián)合抗血管生成治療（IMpower150）；免疫聯(lián)合放療；上述治療策略選擇時(shí)優(yōu)先順序如何考慮？本研究中TMB的預(yù)測(cè)價(jià)值主要針對(duì)雙免疫治療，那么TMB對(duì)于免疫聯(lián)合化療的預(yù)測(cè)作用又將如何？以及TMB對(duì)于免疫單藥是否也存在具有臨床意義的Cutoff值？以上問題期待更多研究來探索。

（感謝葉仁仁文字整理）

https://www.ncbi.nlm./pubmed/29658845