Co-IP是檢測(cè)分子間相互作用的常用技術(shù)，德泰發(fā)現(xiàn)有很多實(shí)驗(yàn)人員反映在查看論文文獻(xiàn)的過(guò)程中，遇到Co-IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖不知道如何進(jìn)行分析。本文從不同的文獻(xiàn)中找了四個(gè)Co-IP的結(jié)果圖，用案例的方式對(duì)如何分析Co-IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖進(jìn)行介紹。

Co-IP結(jié)果如何看？

首先需要說(shuō)明的是，熟悉了解免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)的原理及實(shí)驗(yàn)的操作流程是進(jìn)行Co-IP結(jié)果圖分析的前提。在清楚知道Co-IP操作流程的前提下，弄清楚圖中各個(gè)部分所代表的實(shí)驗(yàn)步驟，結(jié)合圖中展示的結(jié)果進(jìn)行分析，便可以看懂Co-IP的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。

Co-IP結(jié)果分析案例一

該圖為驗(yàn)證蛋白EDR1與蛋白EDR4之間是否存在相互作用的結(jié)果圖。由圖中可以得到，蛋白EDR4帶有GDP標(biāo)簽，蛋白EDR1帶有FLAG標(biāo)簽，該實(shí)驗(yàn)為利用蛋白標(biāo)簽來(lái)沉淀和檢測(cè)蛋白；該co-ip實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)被分為兩組，第一組存在GFP標(biāo)簽及EDR1-FLAG蛋白，第二組存在EDR4-GFP蛋白及EDR1-FLAG蛋白；圖中共有三組膠圖，分別是Inut組，IP組，以及CO-IP組。基本情況得到之后，開(kāi)始進(jìn)行分析：

觀(guān)察圖片的順序?yàn)镃o-IP實(shí)驗(yàn)操作順序相同。首先觀(guān)察Input組，即陽(yáng)性獨(dú)照組。第一塊膠圖為利用anti-FLAG沉淀FLAG標(biāo)簽，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)條帶都在130kd處有蛋白，說(shuō)明兩組實(shí)驗(yàn)都存在EDR1-FLAG蛋白且其大小為130kd，第二塊膠圖為利用anti-GFP標(biāo)簽沉淀GFP標(biāo)簽，發(fā)現(xiàn)第一條帶在25kd存在蛋白而第二條帶在130kd存在蛋白，說(shuō)明第一組實(shí)驗(yàn)存在GFP標(biāo)簽，且大小為25kd，第二組實(shí)驗(yàn)存在EDR4-GFP蛋白且大小為130kd。隨后觀(guān)察IP組，該組圖表示的是利用anti-FLAG對(duì)EDR1-FLAG蛋白進(jìn)行沉淀，圖上顯示兩組實(shí)驗(yàn)在130kd都存在蛋白，說(shuō)明兩組實(shí)驗(yàn)的EDR1-FLAG被沉淀下來(lái)。最后觀(guān)察CO-IP實(shí)驗(yàn)組，該組圖表示在IP組的基礎(chǔ)上進(jìn)一步利用anti-GFP檢測(cè)GFP標(biāo)簽，圖上顯示第一組實(shí)驗(yàn)沒(méi)有條帶，而第二組實(shí)驗(yàn)在130kd處有蛋白。說(shuō)明IP組沒(méi)有把GFP標(biāo)簽共沉淀下來(lái)，但是把EDR4-GFP蛋白共沉淀下來(lái)了。說(shuō)明EDR1-FLAG蛋白不能與GFP標(biāo)簽相互作用，但是可以與EDR4-GFP蛋白相互作用，由此可得到結(jié)論：EDR1蛋白可以與EDR4蛋白存在相互作用。

Co-IP結(jié)果分析案例二

該圖為驗(yàn)證蛋白ChREBP與蛋白HDAC1之間是否存在互作的結(jié)果圖。蛋白ChREBP帶有FLAG標(biāo)簽，蛋白HDAC1帶有Myc標(biāo)簽。該實(shí)驗(yàn)是利用標(biāo)簽抗體去沉淀及檢測(cè)帶有標(biāo)簽的蛋白。該實(shí)驗(yàn)共有三組，第一組為加Myc-HDAC1不加FLAG-ChREBP，第二組為加FLAG-ChREBP不加Myc-HDAC1，第三組為兩個(gè)都加。實(shí)驗(yàn)共有四張膠圖，分別為IB：Myc、IB：FLAG（這兩張膠圖為陽(yáng)性對(duì)照），IP：FLAG IB：FLAG（IP組），IP：FLAG IB：Myc（Co-IP組），基本情況得到之后，開(kāi)始進(jìn)行分析：

最下面兩個(gè)膠圖為利用IB驗(yàn)證Myc-HDAC1及FLAG-ChREBP存在的陽(yáng)性對(duì)照。第二張膠圖表示的實(shí)驗(yàn)操作是利用anti-FLAG沉淀FLAG-ChREBP蛋白，圖上顯示經(jīng)IB驗(yàn)證第二、第三組FLAG-ChREBP蛋白被成功沉淀下來(lái)，而第一組沒(méi)有結(jié)果（第一組不存在FLAG-ChREBP蛋白）。第一張膠圖表示在anti-FLAG沉淀FLAG-ChREBP蛋白的基礎(chǔ)進(jìn)行IB檢測(cè)驗(yàn)證Myc-HDAC1蛋白是否存在。圖上顯示第一、第二組實(shí)驗(yàn)沒(méi)有檢測(cè)到（第一組不存在FLAG-ChREBP蛋白，第二組不存在Myc-HDAC1蛋白），但是第三組實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到了Myc-HDAC1蛋白。由此可以得到結(jié)論：兩個(gè)蛋白都存在的時(shí)候，當(dāng)FLAG-ChREBP蛋白被沉淀，Myc-HDAC1蛋白也會(huì)被共沉淀下來(lái)，ChREBP蛋白與HDAC1蛋白之間存在相互作用。

Co-IP結(jié)果分析案例三

該圖為驗(yàn)證蛋白X與蛋白Y是是否存在相互作用的結(jié)果圖。由圖可以發(fā)現(xiàn)，該實(shí)驗(yàn)被分為兩組：input組及IP組，有兩塊膠圖，第一塊是IB驗(yàn)證蛋白X的存在，第二塊是IB驗(yàn)證蛋白Y的存在。由對(duì)照組的條帶可以得到結(jié)論：蛋白X與蛋白Y都是存在的。IP組的第一個(gè)條帶表示利用IgG進(jìn)行沉淀實(shí)驗(yàn)，結(jié)果蛋白X與蛋白Y沒(méi)有被沉淀下來(lái)，說(shuō)明蛋白X、蛋白Y不能與IgG結(jié)合（陰性對(duì)照，用于排除蛋白與抗體非特異性結(jié)合的可能性）；IP組的第二條帶表示利用蛋白X進(jìn)行沉淀實(shí)驗(yàn)，結(jié)果蛋白X被沉淀下來(lái)，蛋白Y也被沉淀下來(lái)，由此得到結(jié)論：蛋白X-蛋白Y之間存在相互作用。

Co-IP結(jié)果分析案例四

該圖為驗(yàn)證CAT3蛋白與CPK8蛋白之間存在相互作用的結(jié)果圖。由圖可以得到，兩個(gè)蛋白分別加了標(biāo)簽，利用標(biāo)簽進(jìn)行蛋白的沉淀及檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)共分三組，第一組為存在GFP-CAT3，不存在cMyc-CPK8；第二組為存在cMyc-CPK8不存在GFP-CAT3，第三組為兩個(gè)都存在。實(shí)驗(yàn)共有兩組膠圖，一組為陽(yáng)性對(duì)照組（Input組），另外一組為實(shí)驗(yàn)組（Output組）。由Input組可以得到結(jié)論：三組實(shí)驗(yàn)中的組分都是正確的。分析Output組發(fā)現(xiàn)：anti-cMyc在第二、第三條泳帶都有，而anti-GFP只有第三條帶有蛋白，由此推測(cè)實(shí)驗(yàn)組的實(shí)驗(yàn)操作為利用anti-cMyc進(jìn)行沉淀實(shí)驗(yàn)，在利用IB檢測(cè)GFP-CAT3的存在。從實(shí)驗(yàn)組第三條帶可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)cMyc-CPK8蛋白被沉淀下來(lái)時(shí)GFP-CAT3蛋白也會(huì)被共沉淀下來(lái)，由此得到結(jié)論：cMyc-CPK8蛋白與GFP-CAT3蛋白存在相互作用。

Co-IP和GST pull-down的區(qū)別

Co-IP和GST pull-down都是用于檢測(cè)蛋白相互作用的實(shí)驗(yàn)，兩者有很多相似之處，如只能檢測(cè)強(qiáng)相互作用、只能定量分析、不能檢測(cè)瞬時(shí)相互作用等。同時(shí)兩者在原理及實(shí)驗(yàn)操作上也存在一定的區(qū)別，下文就Co-IP和GST pull-down在原理及操作流程上的區(qū)別做一簡(jiǎn)述。

Co-IP和GST pull-down原理區(qū)別

GST pull-down方法的基本原理是：利用重組技術(shù)將探針蛋白與GST融合，融合蛋白通過(guò)GST與固相化的載體上的GTH親和結(jié)合。因此，當(dāng)與融合蛋白有相互作用的蛋白通過(guò)層析柱時(shí)或與此固相復(fù)合物混合時(shí)就可被吸附而分離。

GST pull-down實(shí)驗(yàn)原理圖

Co-IP實(shí)驗(yàn)原理圖

免疫共沉淀（Co-IP）原理為用某一蛋白的抗體，在細(xì)胞裂解液中與相應(yīng)的蛋白（誘餌蛋白）結(jié)合，用Protein A/G將抗原抗體復(fù)合物拉下，最后在拉下的復(fù)合物中檢測(cè)是否存在與誘餌蛋白相結(jié)合的目的蛋白。

Co-IP和GST pull-down實(shí)驗(yàn)操作區(qū)別

Co-IP實(shí)驗(yàn)為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)條件，蛋白質(zhì)的相互作用可以在天然狀態(tài)下進(jìn)行，其優(yōu)點(diǎn)為可以避免人為影響，還可以分離得到天然狀態(tài)下相互作用的蛋白復(fù)合體，缺點(diǎn)是無(wú)法證明兩個(gè)蛋白之間是直接的相互作用還是間接的相互作用；GST pull-down實(shí)驗(yàn)為外實(shí)驗(yàn)條件，可以去除其它蛋白的影響，從而確定目的蛋白和待檢測(cè)蛋白是否可以發(fā)生直接相互作用。但由于其實(shí)驗(yàn)條件為非天然條件，可能會(huì)使實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性，即因?yàn)殡姾勺饔玫挠绊懺斐傻奈剑皇巧硇缘南嗷プ饔谩?/p>

表1：Co-IP實(shí)驗(yàn)與GST pull-down實(shí)驗(yàn)比較