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導(dǎo)讀 核糖體小亞基（英文：Ribosomal Small
Subunit，簡稱“SSU”）是核糖體中較小的核糖體亞基。每個核糖體都由一個核糖體小亞基與一個核糖體大亞基共同構(gòu)成。小亞基核糖體RNA（SSU rRNA）基因，如細(xì)菌中的16S和真核生物的18S，是微生物的分子“身份證”，常用于微生物多樣性和分類等研究。傳統(tǒng)方法難以避免擴(kuò)增引物偏倚性影響結(jié)果，而對SSU
rRNA進(jìn)行全長測序可以消除這種局限性，更準(zhǔn)確的鑒定微生物。1990年，有研究報導(dǎo)能夠從復(fù)雜環(huán)境樣品中獲得的一些16S rRNA序列，打開了研究地球上未知微生物世界的大門。近年來，SSU rRNA 的測序常常用于微生物的研究。SILVA數(shù)據(jù)庫中約有近200萬條的全長SSU序列。大多數(shù)全長的SSU序列都是通過PCR擴(kuò)增，測序拼接獲得的，成本高。二代測序的得到的序列短，雖然三代測序序列長，但測序錯誤率高，通量低，價格貴。測序技術(shù)的缺陷、缺少好的通用引物等限制了研究者發(fā)現(xiàn)、認(rèn)識新的物種。 本研究基于SSU共有的poly（A）合成cDNA，構(gòu)建文庫進(jìn)行測序，分析7種環(huán)境樣本的微生物群落構(gòu)成。 本研究基于SSU共有的poly（A）合成cDNA，構(gòu)建文庫進(jìn)行測序，分析7種環(huán)境樣本的微生物群落構(gòu)成。
原名：Retrieval
of a million high-quality, full-length microbial 16S and 18S rRNA gene
sequences without primer bias 譯名：基于16S和18S rRNA基因的全長無偏差測序研究微生物多樣性 期刊：Nature
biotechnology IF：41.667 發(fā)表時間：2018年 通訊作者：Mads Albertsen 作者單位：奧爾堡大學(xué) 1 測序方法的建立 1.1 DNA樣品準(zhǔn)備 提取樣品中RNA，采用凝膠電泳法選擇目標(biāo)片段?；诤怂醦oly（A）合成單鏈cDNA。依據(jù)模板合成雙鏈cDNA。 
圖1 cDNA合成過程 1.2 構(gòu)建文庫測序 雙鏈DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，采用凝膠電泳法進(jìn)行純化，純化后片段再次擴(kuò)增，用于建立測序文庫(Read-tag library)與建立接頭文庫(Linked-taglibrary)。拼接測序片段， PCR擴(kuò)增，高通量測序獲取SSU序列，利用inner引物擴(kuò)增接頭文庫進(jìn)行測序。 
圖2 構(gòu)建文庫測序 將具有相同接頭文庫的序列歸為一類，分為一類的基因序列進(jìn)行拼接，獲得SSU的全長序列，進(jìn)行物質(zhì)注釋。 
圖3 數(shù)據(jù)分析 本研究獲得了61,266條古細(xì)菌全長16S序列，比目前整個SILVA數(shù)據(jù)庫中的古細(xì)菌序列還多。通過聚類之后，得到3,410個古細(xì)菌的OUT；獲得了70,883條真核生物18S序列，得到415個真菌的OTU。獲得的1，168，276 條LSU 序列，比目前整個SILVA數(shù)據(jù)庫的LSU序列還要多。通過序列相似度比對細(xì)菌和古細(xì)菌數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)了大量新的綱、目、科等分類單元。同時，系統(tǒng)發(fā)育分析顯示幾個位于系統(tǒng)發(fā)育樹底部的古細(xì)菌與已知的任何古細(xì)菌分支聚在一起，而是單獨聚成幾支。
圖4 生命樹覆蓋率 本研究采用Escherichia coli MG 1655, Bacillus subtilis str. 168和 Pseudomonas aeruginosa PAO1 3種菌的混合群落，評估研究方法的錯誤率以及嵌合體數(shù)量。結(jié)果顯示，在一個Illumina MiSeq Run 中，平均的測序錯誤率為0.17%，嵌合體比例為0.4%。測序錯誤率與PCR反應(yīng)時的Taq酶的錯誤率基本一致。嵌合體比例比傳統(tǒng)的基于PCR反應(yīng)的方法低50倍。
圖5 古細(xì)菌覆蓋率 本研究通過多步驟優(yōu)化得到小亞基核糖體RNA（SSU rRNA）全長cDNA，采用高通量方法獲得高質(zhì)量、無引物偏倚的SSU rRNA全長序列。建立方法分析不同環(huán)境中的微生物群落構(gòu)成。結(jié)果顯示，該方法的錯誤率低，結(jié)果信息量大，發(fā)現(xiàn)約50%的新物種。通過與SILVA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)了大約有58%的OTU與SILVA差異度大于97% ，可見環(huán)境中還有大量的新物種未被人們發(fā)現(xiàn)。 本研究依據(jù)核糖體的全長對不同環(huán)境中的樣品進(jìn)行研究，該方法能夠有效擴(kuò)充現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫，完善微生物的分類，促進(jìn)人類對地球上未知微生物的認(rèn)識。 本文由李紅霞編譯，李紅霞、江舜堯編輯。
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