腸道菌群的總數有10的12次方個，其細胞種類有1000至1150種，并且廣泛分布于結直腸，腸道菌群檢測廣泛應用于腸道正常菌群的分析,IBS、腸道致病菌感染與腸道菌群失調的診斷、指導性治療與療效監(jiān)測以及結直腸癌早期篩查,也見于IBS、潰瘍性結腸炎、過敏性皮炎和克羅恩病等多種疾病的發(fā)病機制與病因研究。然而由于腸道菌群的復雜性,檢測與分辨正常菌群和致病菌均具有極大的挑戰(zhàn)性。隨著分子技術的飛速發(fā)展,近十余年來該領域也取得了較大的進展,了解與評價現有的各種腸道菌群研究的技術手段及其優(yōu)缺點對于在臨床研究和應用中合理選擇相應的方法將非常重要。

　　目前的幾種方法既有優(yōu)點又有缺點，我們應該最大限度的運用其優(yōu)點，以及結合其它的技術方法取長補短，發(fā)揮出腸道菌群檢測的最大優(yōu)勢！

　　1，細菌培養(yǎng)

　　理論上,培養(yǎng)是分析細菌活性、生長狀態(tài)、菌落數、優(yōu)勢菌群或致病菌群最理想的方法。最早IBS菌群分析的研究就是采用的細菌培養(yǎng)的方法。但是細菌培養(yǎng)有很多局限性:(1)由于腸道菌群的復雜性,難以采用一種或者幾種培養(yǎng)基對不同的菌種進行培養(yǎng),因而腸道大部分的細菌不能通過培養(yǎng)檢測出來;(2)培養(yǎng)基使用的不同可能造成實驗結果的差異;(3)培養(yǎng)方法敏感性較差,可能造成低豐度細菌的漏檢或細菌數量的低估;(4)并且糞便細菌培養(yǎng)費時費力,成本很高。因此,培養(yǎng)提供的信息可能不完全或者是有偏差。

　　2，16SrRNA、16SrDNA檢測

　　16SrRNA為原核生物的核糖體RNA,該基因在細菌各種屬之間既有高度保守的序列又有相互之間存在差異的堿基,同時該基因還具有種類少、豐度高(約占細菌RNA含量的80%)、分子大小適中的優(yōu)點,因此廣泛用作細菌種屬鑒定的依據。Kassinen等通過16SrRNA探針雜交發(fā)現IBS有明顯的菌群改變,主要菌群為糞腸球菌、柯林氏菌、糞腸桿菌。但16SrRNA基因只能鑒定已知菌群,而腸道細菌大多是未知的,且16SrRNA基因穩(wěn)定性差,易被降解。目前已經探究并具有應用價值的16SrRNA探針較少,且某些探針在菌群之間存在交叉反應,因而限制了該技術在細菌檢測中的應用。16SrDNA是編碼原核生物核糖體小亞基rRNA(16SrRNA)的基因,長度約1500bp。16SrDNA較16SrRNA穩(wěn)定,不易受污染降解,易于發(fā)現新的菌種,比如Takano等通過16SrDNA擴增技術,在硬蜱中檢測到新的大腸埃希菌種,并命名為Ehrlichiasp.360。焦磷酸測序分析16SrDNA顯示使用萬古霉素可使腸道正常菌群發(fā)生改變。以16SrDNA鑒定菌群存在的主要問題有二:(1)細菌的DNA碎片(死菌)可能導致假陽性,因而無法區(qū)別是細菌的感染狀態(tài)或恢復期;(2)以序列比對為基礎建立起來的16SrDNA基因診斷,要想成為一種臨床檢測的常規(guī)方法,還需要一個強大的質控序列數據庫,而目前的數據庫還不夠完善,要在短短的一個或者兩個可變區(qū)內(近百個堿基)找到足夠多的差異信息幾乎是不可能的。

　　3熒光原位雜交

　　熒光原位雜交技術(FISH)是根據不同分類級別上已知微生物的種群特異性DNA序列,利用熒光標記的特異寡聚核苷酸片段作為探針,與目標基因組中DNA分子雜交,檢測該微生物種群的存在與豐度。Swidsinski等采用FISH技術,發(fā)現65%的IBS患者腸黏膜菌群濃度大于109/ml,其中超過40%的菌群屬于直腸優(yōu)桿菌-球形梭菌屬。Kerckhoffs等運用FISH技術,則檢測到IBS患者糞便雙歧桿菌顯著減少,約為正常人群一半,象牙海岸梭菌水平降低,而其他菌群無顯著變化,IBS

　　亞群之間無明顯不同。FISH檢測還發(fā)現幽門螺桿菌也可能在IBS發(fā)病機制中起著重要作用。FISH可提供微生物形態(tài)學、數量、空間分布的信息,具有快速、準確、原位等諸多優(yōu)點,且因雜交的是整個細胞,省去了提取DNA、PCR擴增克隆等

　　步驟。FISH也有缺點,當細菌為芽孢、放線菌或處于休眠時期,細胞膜通透性降低,都會影響菌落中部分種屬豐度的正確估計,而且不能檢測出樣品中的未知種屬。

　　4.1多重PCR

　　多重PCR是在同一反應中采用多對引物同時擴增幾個不同的DNA片段。如果基因某一區(qū)段缺失,則相應的電泳圖譜上此區(qū)段PCR擴增產物長度減少或消失,從而發(fā)現基因異常。多重PCR可檢測腹瀉患者糞便中血清變異型沙門氏菌的毒力基因,其檢測特異性達100%,還可同時檢測腹瀉患者糞便中的沙門氏菌、大腸埃希菌、志賀菌3種菌屬的毒力基因。該方法具有靈敏、快速特點,特別適用于檢

　　測單拷貝基因缺失、重排、插入等異常改變,且可檢測小片段缺失。其優(yōu)缺點有:(1)高效性,在同一反應管內同時檢測多種病原菌或對多個目的基因進行擴增分析;(2)系統性,可對一組病原菌進行分析;(3)經濟簡便性,大大節(jié)省時間和試劑;(4)該方法較單一PCR更為復雜,實際操作中常遇到擴增效率下降、非特異性擴增等問題,一旦有極少量外源性DNA污染,就可能出現假陽性結果;(5)多對引物同時擴增,各種實驗條件控制不當,很容易導致擴增失敗或非特異性產物;(6)引物的設計及靶序列的選擇不當等都可能降低其靈敏度和特異性等。

　　4.2實時熒光定量PCR

　　實時熒光定量PCR(Real-timePCR)是在PCR技術上利用不同的熒光檢測定量核酸的技術,廣泛應用于基因分型,單核苷酸多態(tài)性,等位基因突變檢測等方面。運用定量PCR檢測腹瀉患者糞便中的難辨梭狀芽孢桿菌[11],其特異性為95.1%,靈敏

　　性96%,陽性預測值為64.9%,陰性預測值為99.6%。Malinen等[12]運用定量PCR技術檢測腸道大約300種菌群,發(fā)現與正常人群相比,腹瀉型IBS患者乳桿菌明顯減少,而便秘型IBS患者韋榮球菌增加,所有IBS患者球形梭菌和鏈狀雙歧桿菌減少,未檢測到致病菌幽門螺桿菌或難辨梭狀芽孢桿菌,僅有1例IBS患者檢測到空腸彎曲菌。該實驗表明定量PCR能通過快速準確定量方法檢測眾多腸道正常菌群和致病菌群數量。Tana等的研究也證實IBS患者糞便中韋榮球菌增多,但與前者

　　研究結果不同的是IBS患者乳桿菌亦明顯增加,同時用高效液相色譜檢測到IBS患者腸道產酸增加。Kerckhoffs等用定量PCR方法分析雙歧桿菌組成發(fā)現,IBS患者十二指腸刷片和糞便菌群中鏈狀雙歧桿菌顯著降低。而Krogius-Kurikka等運用

　　定量PCR技術進一步發(fā)現腹瀉型IBS患者糞便菌群中蛋白菌和梭菌屬細菌增多,而放線菌屬和擬桿菌屬減少。Lyra等運用此技術也證實了腹瀉型IBS腸道菌群與其他類型IBS顯著不同,主要為琥珀酸嗜熱梭菌減少,瘤胃球菌增多。之后,他們觀

　　察了益生菌對IBS患者菌群的影響,發(fā)現IBS患經益生菌治療后瘤胃球菌數量明顯減少,琥珀酸嗜熱梭菌數量穩(wěn)步上升,而安慰劑組IBS患者糞便中仍存在大量瘤胃球菌。定量PCR還可結合反轉錄PCR用于檢測糞便菌,最低檢測限為102～

　　103CFU/g(colony-formingunit)糞便,檢測的敏感性、特異性超過普通定量PCR的100倍以上。定量PCR較培養(yǎng)和FISH計數敏感10～100倍,適合多樣本分析和復雜菌群檢測,全程閉管操作,污染概率降低,可監(jiān)測反應全程,定量過程自動化。商品化。因而該方法具有靈敏度高、特異性強、重復性好、速度快等優(yōu)點。但該技術亦有明顯的不足之處:(1)由于運用了封閉的檢測,減少了擴增后電泳的檢測步驟,因此也就不能監(jiān)測擴增產物的大小;(2)因為熒光素種類以及檢測光源的局限

　　性,從而相對地限制了其多重檢測的應用能力;(3)PCR過程中任一因素的細微變化均要導致最終結果的巨大差異,PCR反應前的提取方法的效率差異存在,往往可引起最終定量結果的顯著差異;(4)該技術采用熒光淬滅及雙末端標記技術,可能造成淬滅難以徹底;(5)探針標記成本較高,不便普及應用。

　　5，基因芯片

　　此前介紹的方法單次能夠檢測的標本或菌種少,難以應對種類繁多的腸道菌群,因而催生了能夠同時檢測多種細菌或不同標本的高通量化分析方法———基因芯片。基因芯片(GeneChip),又稱為DNA微陣列(DNAmicroarray),通常指DNA芯片,其基本原理是將大量探針(通常每平方厘米點陣密度高于400)固定于支持物上,然后與標記的樣品進行雜交,通過檢測雜交信號的強弱進而判斷樣品中靶分子的數量?；蛐酒哂形⑿突?、高通量、集約化和標準化等特點。該技術已經廣泛應用于菌群分析,尤其是有益于腸道菌群的檢測?；蛐酒捎糜跈z測正常人群和IBS患者腸道菌群分布。Paliy等用基因芯片分別檢測到兒童的腸道細菌為227～232種,成人為191～208種,其中主要菌屬為梭狀芽孢桿菌和擬桿菌,兩組人群菌群存在顯著性差異,與兒童相比,成人梭桿菌多,擬桿菌和蛋白菌少。該研究還表明,基因芯片的檢測靈敏度可達到1pgDNA,可檢測占總樣本0.00025%的細菌。用基因芯片檢測到IBS患者通過益生菌治療后糞便菌群相似性指數升高,而安慰劑對照組相似性指數降低,提示益生菌的攝入可使腸道菌群穩(wěn)定性增加?；蛐酒€可與其他技術聯合使用,便于定量檢測和指紋圖譜分析。Bjerketorp等將基因芯片與長度異質性PCR(LH-PCR)相結合,用于檢測抗生素使用前后腸道菌群的改變,結果表明抗生素使用期間部分腸道細菌出現增減變化,且這種變化持續(xù)到抗生素治療結束。Candela等將基因芯片與連接酶檢測反應技術(LDR)相結合,可以快速、敏感、準確地檢測腸道菌群。Nelson等采用PhyloChip技術(針對16SrRNA的基因芯片),發(fā)現大鼠模擬的便秘型IBS模型的結直腸內細菌種類增加,硬壁菌門細菌與擬桿菌屬之比明顯改變,擬桿菌屬明顯增加?；蛐酒呀洀V泛應用于微生物研究,并具有廣闊的應用前景,但是其技術缺陷仍不能滿足臨床檢驗的需要?；蛐酒捌诘奶崛〖兓^程需要手動操作,因而結果可能引入人為誤差、污染等問題。基因芯片涉及手動細菌DNA提取,所以不同的提取方法可能影響最終的檢測結果。Salonen等比較了差異離心法、酶裂解細胞法、反復磁珠敲打法和QiaAmp糞便DNA提取試劑四種DNA提取方法,發(fā)現反復磁珠敲打的方法優(yōu)于其他3種方法,能更好提取古生菌和梭桿菌的DNA,且通過該法測得古生菌在健康人群中占67%,明顯高于之前所報道的比值(45%)?；蛐酒募夹g成本昂貴、復雜、重復性差、分析范圍較狹窄、無法鑒定亞群以及靈敏度等問題也限制了基因芯片的發(fā)展。

　　隨著生物技術的發(fā)展,菌群分析的方法學也取得了較大進展。了解各種菌群分析的方法學特點并合理運用,對于保證腸道菌群檢測的準確性及其臨床應用具有重要意義。