基于PCR的分子診斷是通過引物介導(dǎo)特異性擴增目的基因以檢測內(nèi)源性（遺傳或變異）或外源性（病原體）目的基因的存在與否，進而對疾病的診斷和治療提供信息和決策依據(jù)。

其主要的應(yīng)用場景有傳染病的診斷，血篩，腫瘤早期輔助診斷，腫瘤的分子分型，遺傳病的診斷，產(chǎn)前診斷，組織分型等。

其中在傳染病的診斷和血篩方面，基于PCR的分子診斷能縮短診斷的“窗口期”，并且可以定量對病原體進行檢測。

相比于傳統(tǒng)的免疫診斷方式而言，有不可替代的優(yōu)勢。基于PCR的分子診斷往往是醫(yī)院對傳染病診斷的“金標(biāo)準”。

在血篩方面，有數(shù)據(jù)表明，美國90％以上輸血傳播HIV和HBV以及75％以上輸血HCV的危險性均來自“窗口期”感染獻血。

在我國，2015 年 2 月，衛(wèi)計委和財政部聯(lián)合印發(fā)《關(guān)于做好血站核酸檢測工作的通知》: 全面推進血站核酸檢測工作，確保 2015 年血站核酸檢測覆蓋全國并優(yōu)先選擇國產(chǎn)核酸檢測系統(tǒng)及試劑。

圖1. HIV早期診斷，檢測RNA含量的分子診斷大大縮短了診斷的“窗口期”

基于PCR的分子診斷分為三步：

核酸的提取和純化；

核酸在引物約束下特異性地PCR擴增；

擴增產(chǎn)物的檢測。

在實時熒光定量PCR里，往往PCR擴增和擴增的產(chǎn)物的檢測是同時進行的。在醫(yī)院的臨床應(yīng)用中，往往為了避免交叉污染，往往需要試劑準備、標(biāo)本制備和PCR擴增檢測三個獨立的實驗區(qū)。

圖2. 基于PCR的分子診斷的一般流程

在第一步的核酸提取和純化工程中，一般采用的是磁珠法或者硅膠膜法。兩個方法的實質(zhì)都是用二氧化硅顆粒來吸附DNA分子，只不過磁珠法是將二氧化硅顆粒預(yù)先固定在磁珠表面，而硅膠膜法是將二氧化硅顆粒均勻固定在兩層半透膜之間。

圖3.實驗室基于磁珠的核酸提取方法

在PCR擴增中，核心是溫控。主要因為PCR一般需要變性，退火，延伸三個階段，每個階段對應(yīng)需要不同的溫度。

在實際應(yīng)用中，往往可以采取兩種方式來實現(xiàn)溫度的切換：

直接溫控，對反應(yīng)腔進行加熱或者降溫；

預(yù)先設(shè)置三個處在不同位置的溫區(qū)，讓反應(yīng)腔在三個溫區(qū)之間進行空間上的切換。

實際產(chǎn)業(yè)化中，往往使用的是直接溫控法，即直接升溫降溫。

熒光檢測往往是和PCR擴增同時進行的，以實現(xiàn)實時定量的效果。在實際應(yīng)用中，可以使用不同波段的熒光標(biāo)記探針來進行熒光定量，從而實現(xiàn)多通道的檢測。

圖4. PCR流程以及其相應(yīng)的典型溫度

由于基于PCR的分子診斷的人工操作需要三個實驗區(qū)，過程費時并且需要專業(yè)人員進行操作，整個過程由于人的參與帶來許多不可控的因素，所以臨床對于全自動的需求高漲。

這一塊有幾個明星產(chǎn)品：

賽沛（Cepheid）的GeneXpert PCR分析儀

(參考《分子診斷精品之一 GeneXpert PCR分析儀》)

BioFire的filmArray

(參考《分子診斷精品之二  FilmArray多重PCR分析儀》)

IQuum的Liat PCR System

 (分子診斷精品之三以后會寫...)

AtlasGenetics的io

 (參考《萬孚投資英國AG公司，所為何事？》)

這幾個明星產(chǎn)品的孵化公司中，前三家均被巨頭收購，第四家也備受投資機構(gòu)追捧。

2016年9月，賽沛被丹納赫以40億美元收購；

2013年9月，BioFire被生物梅里埃以4.5億美元收購；

2014年4月，IQuum 被羅氏以4.5億美元收購；

2016年底，萬孚生物以約1.25億人民幣投資Atlas Genetics，獲得14.95%的股權(quán)。

競爭激烈和受歡迎程度由此可見一斑。值得注意的是，這四個產(chǎn)品都是基于微流控的分子診斷產(chǎn)品。

另外，國內(nèi)的博暉創(chuàng)新也于2017年發(fā)布了一款微流控全自動核酸檢測系統(tǒng)。

目前來看，在基于PCR分子診斷的全自動化上，微流控技術(shù)具有非常大的優(yōu)勢。下面我們來重點從技術(shù)角度來解析這幾款基于微流控的明星產(chǎn)品。

生物梅里埃FilmArray 

這款產(chǎn)品的一大特色是它能實現(xiàn)比較高的并行檢測，而且它采用了巢式PCR技術(shù)，使用兩對引物擴增，第二對引物結(jié)合在第一次擴增的產(chǎn)物的內(nèi)部，這樣增強了PCR擴增的特異性，降低了誤擴率。

圖5. FilmArray的微流控芯片結(jié)構(gòu)

羅氏cobas Liat

這個產(chǎn)品采用非傳統(tǒng)的微流控芯片結(jié)構(gòu)。整個芯片類似于試管形狀，檢測管包含所有檢測試劑并已分裝入每一個獨立區(qū)段，將所有核酸檢測程序融為一體。其中包含試劑準備、樣本富集、抑制物清除、核酸提取及實時熒光定量檢測。分析儀通過對檢測管壓力推動，將樣本從不同區(qū)段通過，最后通過溫控進行PCR擴增。

Atlas Genetics的io system

 微流控芯片內(nèi)部跟傳統(tǒng)的一樣，采用的在相應(yīng)腔室施加正壓或者負壓來操控微流體的流動，以實現(xiàn)整個檢測的流程。但是，這個產(chǎn)品在檢測方面采用了電化學(xué)檢測。

其電化學(xué)檢測的原理大概為：

先不對稱PCR，產(chǎn)生大量單鏈DNA;

然后單鏈PCR產(chǎn)物與電化學(xué)物質(zhì)的探針結(jié)合，生成雙鏈DNA;

雙鏈DNA產(chǎn)物會被核酸外切酶消化，從而釋放出被標(biāo)記的電化學(xué)物質(zhì);

最終通過電壓掃描判讀結(jié)果。

圖6. 博暉創(chuàng)新的微流控全自動核酸檢測系統(tǒng)（HPV）

博暉創(chuàng)新的微流控全自動核酸檢測系統(tǒng)：這個產(chǎn)品的微流控芯片也是通過在相應(yīng)的腔室施加正壓或者負壓來驅(qū)動微流體在芯片中的流動。在此基礎(chǔ)上，這個產(chǎn)品結(jié)合了機械手臂的優(yōu)勢，進一步降低了單次檢測的成本。

此外，2016年來自德國弗萊堡大學(xué)的研究團隊發(fā)表了一套基于離心微流控的分子診斷系統(tǒng)。作為系統(tǒng)的核心，其微流控芯片里做到了試劑的預(yù)存儲，核酸提取純化，PCR擴增的全部集成。

圖7. Stumpf, F, et al. Lab on A Chip. (2016)

試劑預(yù)先存儲在棒狀的鋁箔里，通過不同的離心力來實現(xiàn)試劑的順序加載；

然后，芯片下方的固定的磁鐵完成對芯片里的磁珠的吸附；

轉(zhuǎn)動微流控芯片，芯片下方的磁鐵會帶著磁珠去往相鄰的腔室，從而實現(xiàn)了DNA的提取過程；

提取后的DNA將會等體積的分配到八個PCR反應(yīng)腔室，每個腔室里分別對應(yīng)四種熒光通道。這樣理論上可以實現(xiàn)單樣本32指標(biāo)的檢測。