二代測序技術(shù)（NGS）已廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)踐，體細(xì)胞成藥基因組變化的快速診斷為個(gè)體化癌癥治療提供了條件。然而，體細(xì)胞突變的信號(hào)和生物學(xué)效應(yīng)在人類腫瘤樣本中并沒有確定，并且在大多數(shù)臨床樣本中并沒有通過NGS檢測到成藥基因組的改變。全面的蛋白質(zhì)組學(xué)分析提供了一個(gè)有效的方法，來驗(yàn)證基因組結(jié)果，比如發(fā)現(xiàn)可能的生物驅(qū)動(dòng)因子，尋找針對(duì)性治療策略等。

免疫缺陷小鼠中的人源性腫瘤組織異種移植（PDX）模型可以維持源病人腫瘤組織學(xué)和分子異質(zhì)性，最近有研究確定了PDX和原發(fā)性腫瘤之間相似的蛋白表達(dá)譜。由于患者治療的異質(zhì)性，很難在腫瘤樣本中將治療和蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果建立聯(lián)系。

利用PDX系統(tǒng)，研究試圖揭示，針對(duì)個(gè)體患者，蛋白質(zhì)組學(xué)是否比單獨(dú)基因組分析能提供更有效的治療假設(shè)和預(yù)測生物標(biāo)記物。

因此，這種模擬人腫瘤特異性的模型對(duì)腫瘤臨床前期評(píng)估、治療和預(yù)后具有重要的轉(zhuǎn)化意義，特別是對(duì)于腫瘤的個(gè)體化診斷和治療具有不可代替的價(jià)值。

24例乳腺癌PDX模型，分別來自原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性乳腺癌腫瘤，其中10例basal，1例CLDN-low，9例luminal B及4例HER2陽性。

24個(gè)PDX模型進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)iTRAQ（Isotope Tagging for Relative and AbsoluteQuantitation）分析，利用lable-free定量（LFQ）對(duì)18個(gè)PDX模型進(jìn)行驗(yàn)證和確定。

23個(gè)PDX模型進(jìn)行DNA和RNA測序，并對(duì)一個(gè)樣本進(jìn)行Sanger測序分析熱點(diǎn)突變。

利用DNA-seq、RNA-seq、iTRAQ和LFQ，主要進(jìn)行體細(xì)胞突變譜、拷貝數(shù)變異（CNV）、mRNA表達(dá)、蛋白表達(dá)、磷酸化修飾水平及位點(diǎn)分析。

作者利用24個(gè)PDX模型進(jìn)行全面的蛋白質(zhì)基因組分析，檢測了12個(gè)乳腺癌腫瘤樣本和對(duì)應(yīng)的PDXs中顯著突變基因中的體細(xì)胞突變。結(jié)果表明，這些基因中大部分關(guān)鍵的體細(xì)胞突變被保留，驗(yàn)證了PDX模型的保真度。

RNA-seq數(shù)據(jù)確定了16209個(gè)基因的表達(dá)，iTRAQ則確定了并篩選了10069種蛋白和36609個(gè)磷酸化位點(diǎn)用于后續(xù)分析。iTRAQ和 LFQ數(shù)據(jù)在標(biāo)準(zhǔn)化后顯示合理的相關(guān)性，表明這兩種檢測手段利用相同的PDX模型能夠交叉驗(yàn)證蛋白組結(jié)果。

mRNA表達(dá)和蛋白質(zhì)豐度之間的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，83.6%的基因表現(xiàn)出顯著正相關(guān)。隨后檢測mRNA-蛋白相關(guān)性是否與特定的KEGG信號(hào)通路有關(guān)，結(jié)果表明，一些管家基因在兩個(gè)組學(xué)中都表現(xiàn)出非常強(qiáng)的正相關(guān)性，其中谷胱甘肽代謝通路顯著性最高。

進(jìn)一步檢測乳腺癌關(guān)鍵基因CNV、mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平的相關(guān)性：EGFR，ERBB2（HER2），ESR1，GATA3，PGR，PIK3CA，AKT1 / 2/3，MTOR和TP53，在大多數(shù)樣本中，CNV、mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平是一致的，并且關(guān)鍵基因的整體表達(dá)模式和臨床亞型診斷也是一致的。

圖1  PDX樣本中蛋白質(zhì)基因組相關(guān)性分析

為了探究蛋白質(zhì)組亞型和磷酸化蛋白質(zhì)組亞型，對(duì)iTRAQ結(jié)果的前436種不同表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行聚類分析（標(biāo)準(zhǔn)差大于2），發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)不同的集群，一類包含所有basal和唯一的CLDN-low乳腺腫瘤（WHIM12），另一類包含所有l(wèi)uminal B和HER2-E乳腺腫瘤。

同時(shí)利用iTRAQ磷酸肽表達(dá)數(shù)據(jù)推斷蛋白磷酸化亞型,也產(chǎn)生了兩個(gè)主要的集群，將luminal B和basal亞型分隔開。

圖2  乳腺癌PDX樣本轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)聚類

對(duì)TCGA人腫瘤的77個(gè)蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)進(jìn)行蛋白質(zhì)分型的驗(yàn)證，分析結(jié)果和24個(gè)PDXs聚類的亞型類似。

為了尋找luminal B和basal亞型的定義標(biāo)記，作者對(duì)各個(gè)亞型的PDXs進(jìn)行差異表達(dá)分析，最終發(fā)現(xiàn)了一些在LFQ和iTRAQ中均差異表達(dá)的蛋白標(biāo)記物，包括SPR、GSTP1和SERPINB5。

利用KEGG信號(hào)通路中基因的蛋白質(zhì)磷酸化圖譜，尋找PDXs中腫瘤特異性激活的信號(hào)通路，結(jié)果顯示，磷酸化富集分析確定了12個(gè)顯著激活的信號(hào)通路，包括Ras、MAPK和NFκB通路。

一些已知的信號(hào)通路（如PI3K/AKT/MTOR）在大多數(shù)乳腺癌中被激活，但由于特異的基因組或蛋白組的改變，其他互補(bǔ)的腫瘤發(fā)生相關(guān)通路也在一小部分乳腺癌中被激活，如RAS/MAPK，顯示出可替代的治療機(jī)會(huì)。

除此之外，蛋白質(zhì)磷酸化組分析揭示了不易被基因組數(shù)據(jù)預(yù)測到的的信號(hào)通路的激活。

圖3  磷酸化信號(hào)通路富集分析檢測激活的信號(hào)通路

原癌基因的激活突變可以作為治療靶標(biāo)，同時(shí)異常過表達(dá)或活化蛋白產(chǎn)物也提供了可利用的治療機(jī)會(huì)，比如HER2。因此，作者進(jìn)一步尋找過表達(dá)基因/蛋白質(zhì)或者具有高度磷酸化位點(diǎn)的蛋白質(zhì)。

利用表達(dá)值四分位距（IQR）大于1.5篩選離群值，結(jié)果顯示，mRNA和蛋白表達(dá)離群值顯示出中度的正相關(guān)，但mRNA異常表達(dá)不保證蛋白的高表達(dá)。

相似地，部分磷酸化離群值也沒有在蛋白水平檢測到。因此，基于轉(zhuǎn)錄后和翻譯后事件確定的潛在藥物治療需要同時(shí)考慮蛋白表達(dá)和基因表達(dá)。

蛋白質(zhì)異常事件，如基因組驅(qū)動(dòng)突變，在PDXs和人腫瘤中均觀察到，一些蛋白質(zhì)異常事件可能代表腫瘤發(fā)生的“蛋白驅(qū)動(dòng)”，因此也可能是乳腺癌的潛在藥物靶標(biāo)。

圖4  蛋白質(zhì)基因組分析確定乳腺癌治療靶標(biāo)

利用PDX模型進(jìn)行靶向HER2和PI3K信號(hào)通路的藥物治療，研究結(jié)果顯示，藥物反應(yīng)的程度可能與下游信號(hào)靶標(biāo)有關(guān)，如AKT蛋白的過度和磷酸化。并且，PI3KCA在基因水平和AKTs在蛋白水平的雙重激活可能是乳腺癌的共同特征。研究結(jié)果還顯示出了利用對(duì)乳腺癌蛋白基因組特征進(jìn)行組合治療的可能性。

圖5  乳腺癌異種移植的靶向治療

1.利用PDX模型可獲得與臨床樣本相似的結(jié)果，暗示了該模型應(yīng)用于腫瘤治療和研究的潛在價(jià)值。

2.將基因組和蛋白組進(jìn)行整合分析，更精確地預(yù)測癌癥變化機(jī)理，尋找癌癥治療靶標(biāo)。

3.大多數(shù)藥物作用靶標(biāo)是蛋白，針對(duì)蛋白質(zhì)組進(jìn)行治療藥物篩選及藥物應(yīng)答效果預(yù)測比基因組更為有效。

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參考文獻(xiàn)：

Huang K, Li S, Mertins P, et al. Proteogenomic integration reveals therapeutic targets in breast cancer xenografts[J]. Nature communications, 2017, 8.