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123測序技術(shù)的原理 聲音版 文字版 測序技術(shù)的起源要從1953, Crick and Watson發(fā)現(xiàn)DNA雙鏈模型開始說起，堿基按A-T，G-C配對互補，彼此以氫鍵相聯(lián)系，自此打開了生物學新世界的大門。 第一代測序技術(shù)的發(fā)展 第一代測序技術(shù)的出現(xiàn)以Sanger法的出現(xiàn)為主要標志，Sanger等在1965年發(fā)明了RNA小片段序列測定法，并完成了大腸桿菌5S rRNA的120個核苷酸測定。DNA測序技術(shù)出現(xiàn)的則較晚，1975年Sanger和Coulson發(fā)明了“加減法”測定DNA序列。1977年在引入雙脫氧核苷酸三磷酸（ddNTP）后形成了雙脫氧鏈終止法，使得DNA測定的效率和準確性大大提高，并在1980年獲得諾貝爾化學獎。
Sanger法是根據(jù)核苷酸在某一固定的點開始，隨機在某一個特定的堿基處終止，并且在每個堿基后面進行熒光標記，產(chǎn)生以A、T、C、G結(jié)束的四組不同長度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進行檢測，從而獲得可見DNA堿基序列。 點擊查看廣告：一個接近大牛的機會 1000bp，準確性高達99.999%，但其測序成本高，通量低等缺點嚴重影響了其大規(guī)模使用，盡管如此，它依然“財大氣粗”的完成了水稻、大豆、高粱的全基因組測序和人的基因組測序。除此之外，一代測序技術(shù)中還包括了操作較復雜的化學降解法和基于熒光標記和Sanger的雙脫氧鏈終止法的產(chǎn)生的熒光自動測序儀，目前這種測序儀仍被使用。由于第一代測序技術(shù)并不是最理想的測序方法，所以從那時候人們就開始了對第二代測序技術(shù)的探索。
第二代測序技術(shù)的發(fā)展 第二代測序技術(shù)又稱為高通量測序技術(shù)、下一代測序技術(shù)、深度測序技術(shù)，它一次運行可以對含有幾十萬至上億堿基的DNA或RNA樣品進行測定。跟一代測序技術(shù)相比，極大的增加了數(shù)據(jù)產(chǎn)出，極大的降低了測序成本，使得物種在基因組水平和轉(zhuǎn)錄組水平精細分析成為可能。第二代測序技術(shù)平臺的發(fā)展與現(xiàn)今“共享單車”的發(fā)展頗為相似，具有代表性的現(xiàn)今我們還可以見到的有Illumina公司推出的HiSeq2000、1500/2500、3000/4000、HiSeq X-ten MiSeq、NextSeq500，Life公司推出的Ion-PGM (Personal Genome Machine)，Ion-Proton Qiagen公司推出的GeneReader NGS system等，國產(chǎn)測序儀中，華大(BGI)收購Complete Genetics后推出的BGISeq-100，BGISeq-1000等，而Roche公司的454 GS FLX plus及454 Junior和Life公司的SOLiD 5500已停止技術(shù)研發(fā)，Helicos公司已倒閉并停止對Heliscope技術(shù)平臺的支持。 二代測序技術(shù)的工作原理主要是先將片段化的DNA兩側(cè)連上接頭，隨后用固著著芯片的引物進行Bridge PCR，得到上百萬條相同的DNA簇，再加入4種不同熒光標記的終止型dNTP，每滲入一個此dNTP反應即終止，洗去未參加的dNTP后讀取熒光數(shù)據(jù)，得到一個位點的序列，切去終止dNTP上的阻斷基團后即可進入下一輪測序，如此循環(huán)50次左右。 同時對上百萬個DNA簇進行邊和成邊測序，最后用計算機進行分析，得到DNA簇的序列，最后拼成全基因組序列。
二代測序成本不斷下降，以人類基因組為例，人類基因組大小3Gb，Sanger測序法耗時13年，全世界科學家合作，花費約27億美元，而Illumina HiSeq X ten高通量測序，約需三天，測序費約為1千多美元。截止17年3月，125種植物，180種動物及數(shù)百種微生物的基因組序列得以發(fā)表，絕大部分是框架圖譜，而不是精細圖譜。運用二代測序技術(shù)發(fā)表的農(nóng)作物種類的全基因組有小麥、黃瓜、大麥、馬鈴薯、谷子、棉花和白菜。 第三代測序技術(shù)的發(fā)展 三代測序技術(shù)是以單分子為目標的邊和成邊測序，該技術(shù)不需要經(jīng)過PCR擴增，實現(xiàn)了對每一條DNA的單獨測序，關(guān)鍵技術(shù)是熒光標記核苷酸、納米微孔和激光共聚焦顯微鏡實時記錄微孔熒光，相比二代測序，它能夠產(chǎn)生遠長于二代測序技術(shù)的序列讀長，可以直接測RNA序列也可以測甲基化的DNA序列，在表觀遺傳學研究中有著巨大潛力。盡管如此，它的缺點也不容忽視。三代測序單讀長錯誤率偏高，需要重復測序糾錯，以PacBio SMRT技術(shù)為例，錯誤率高達15%，且隨機出錯，需要進行多次測序糾錯，增加了測序成本。三代測序?qū)NA聚合酶活性依賴度也較高，由于運用率沒有二代測序普遍，其生信分析軟件豐富度不夠，積累較少。
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