上次荷葉介紹了給常規(guī)研究套路加個(gè)“高大上”的理論假說(shuō)來(lái)升華文章的檔次，但是很多時(shí)候沒(méi)有這種理論假說(shuō)怎么辦呢？今天荷葉借一篇研究腫瘤內(nèi)T細(xì)胞的文章一窺其研究套路的升華。

文章梗概：腫瘤抗原特異的CD8+T細(xì)胞是殺傷腫瘤的主力細(xì)胞群，但是腫瘤中的CD8+T細(xì)胞常常“發(fā)揮失常”。

Ying Zhang等通過(guò)研究了在腫瘤微環(huán)境中黑色素瘤抗原特異的CD8+T細(xì)胞的變化，發(fā)現(xiàn)在低氧、低糖的腫瘤微環(huán)境中CD8+T細(xì)胞利用脂肪酸分解代謝供能，維持CD8+T細(xì)胞殺傷能力；同時(shí)他們還發(fā)現(xiàn)促進(jìn)脂肪酸代謝的PPAR激動(dòng)劑能夠與PD-1抗體相互協(xié)同抑制腫瘤生長(zhǎng)。研究成果發(fā)表在2017年9月的《Cancer Cell》上。

第一步，獲得腫瘤抗原特異的TILs。

1）以黑色素瘤細(xì)胞系B16BrafV600E皮下荷瘤3天后，利用腺病毒系統(tǒng)表達(dá)黑色素瘤特異的抗原表位MAA（Trp-1455-463）和E7免疫小鼠；

2）利用OT-1轉(zhuǎn)基因小鼠（表達(dá)OVA抗原表位），皮下接種B16OVA（表達(dá)OVA的B16細(xì)胞）。研究發(fā)現(xiàn)以腫瘤疫苗免疫的小鼠腫瘤生長(zhǎng)緩慢。

第二步，觀察、檢測(cè)隨著腫瘤進(jìn)展腫瘤特異CD8+TILs的變化。作者從細(xì)胞數(shù)目、功能和形態(tài)等方面展開(kāi)研究。

研究發(fā)現(xiàn)隨著腫瘤進(jìn)展，CD8+TILs細(xì)胞數(shù)目逐漸減少，同時(shí)PD-1和LAG-3免疫檢查點(diǎn)表達(dá)水平逐漸升高。對(duì)CD8+TIL的功能研究發(fā)現(xiàn)，其顆粒酶GrmB、IFNr和穿孔素Perforin表達(dá)水平下降。

作者進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)隨著腫瘤進(jìn)展CD8+TILs的線粒體膜電位降低，而線粒體ROS升高。透射電鏡觀察了線粒體的超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)腫瘤生長(zhǎng)時(shí)間長(zhǎng)的CD8+TILs的線粒體腫脹，線粒體嵴減少，這些結(jié)果提示TILs的線粒體隨著荷瘤時(shí)間的延長(zhǎng)而發(fā)生改變。

第三步，探討在腫瘤微環(huán)境中CD8+TILs發(fā)生這些變化的原因。由于腫瘤細(xì)胞的快速增殖能力，消耗大量的氧氣和葡萄糖（有氧糖酵解），因此腫瘤微環(huán)境常常是低氧、低糖的。研究發(fā)現(xiàn)TILs細(xì)胞HIF1α表達(dá)水平隨腫瘤進(jìn)展而升高，HIF1α下游分子Glut1表達(dá)亦升高，這些提示TILs隨著腫瘤進(jìn)展而逐漸缺氧。進(jìn)一步分析血清、荷瘤14天和30天的腫瘤組織的血糖水平，發(fā)現(xiàn)隨著腫瘤進(jìn)展腫瘤內(nèi)血糖逐漸降低。

為了明確HIF1α在TILs和腫瘤中的作用，作者敲低CD8+T細(xì)胞的HIF1α的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)敲低HIF1α后T細(xì)胞的殺傷能力增強(qiáng)。T細(xì)胞過(guò)繼實(shí)驗(yàn)在體內(nèi)證實(shí)敲低HIF1α能夠抑制腫瘤的生長(zhǎng)。

很可能大多數(shù)的研究者研究到這就接近尾聲了，有表型，有機(jī)制，還做了體內(nèi)的挽救實(shí)驗(yàn)，發(fā)個(gè)7-8分的文章還是不成問(wèn)題的。但是這篇文章的作者沒(méi)有淺嘗輒止。

第四步，作者沒(méi)有局限于HIF1α，而是將HIF1α作為一個(gè)引子，換了個(gè)研究角度，從代謝的層面出發(fā)，繼續(xù)深入研究低氧、低糖的腫瘤微環(huán)境中CD8+TILs發(fā)生變化的原因。作者發(fā)現(xiàn)敲低HIF1α后TILs的代謝發(fā)生改變：糖酵解相關(guān)酶表達(dá)下降，脂肪酸代謝相關(guān)酶升高。

作者轉(zhuǎn)換研究角度，分析了CD8+T細(xì)胞低糖、低氧環(huán)境的代謝表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)葡萄糖攝取、糖酵解相關(guān)基因表達(dá)下降，而脂肪酸攝取、脂肪酸代謝相關(guān)基因表達(dá)升高。

通過(guò)同位素標(biāo)記跟蹤13C的去向，作者在腫瘤模型的TILs中驗(yàn)證表達(dá)譜實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，CD8+TILs隨著腫瘤進(jìn)展逐漸由脂肪酸分解代謝供能。同時(shí)對(duì)人腫瘤樣本的研究發(fā)現(xiàn)，黑色素瘤轉(zhuǎn)移灶內(nèi)脂肪酸的含量增高，進(jìn)一步提示脂肪酸分解代謝在腫瘤進(jìn)展中的作用。

第五步，TILs的脂肪酸代謝特征如何影響腫瘤呢？作者通過(guò)PPARα的激活或抑制觀察脂肪酸代謝對(duì)TILs功能的影響：發(fā)現(xiàn)PPARα激動(dòng)劑fenofibrate能促進(jìn)TILs向腫瘤組織的浸潤(rùn)，提高CD8+T細(xì)胞的殺傷能力，抑制黑色素瘤的生長(zhǎng)。

而PPARα敲除后TILs的功能顯著下降，GrmB、IFNr和Perforin表達(dá)水平明顯下降。

第六步，研究了調(diào)節(jié)代謝藥物與腫瘤免疫療法相結(jié)合療法的可行性。作者發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境能夠影響TILs免疫檢查點(diǎn)的表達(dá)水平：HIF1α與LAG-3的表達(dá)呈正相關(guān)（可能與LAG-3啟動(dòng)子上有HIF1α的結(jié)合區(qū)有關(guān)），PPARα與PD-1的表達(dá)呈正相關(guān)。

抑制免疫檢查點(diǎn)抗體與代謝藥物聯(lián)合作用效果如何呢？研究發(fā)現(xiàn)PD-1抗體治療不影響TILs的脂肪酸代謝。但是PPARα激動(dòng)劑fenofibrate能夠協(xié)同PD-1抗體增強(qiáng)腫瘤治療的效果。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在低糖、低氧的腫瘤微環(huán)境中CD8+TILs激活PPARα信號(hào)和脂肪酸的分解代謝，加速脂肪酸的分解代謝（燃燒脂肪）能夠協(xié)同PD-1抗體增強(qiáng)腫瘤治療效果。

科研狗們，你是否有這樣的經(jīng)歷：當(dāng)我們千辛萬(wàn)苦終于確認(rèn)了一個(gè)表型，但是深入研究分子機(jī)制的時(shí)候常常力不從心，越做方向越窄，最終圍繞著某個(gè)分子打轉(zhuǎn)，盡管最終發(fā)了一篇paper，但是連你自己都不很自信，“我找的這個(gè)分子是主要機(jī)制嗎？”如同本篇文章，大多數(shù)人很可能就會(huì)圍繞HIF1α繼續(xù)研究了，其創(chuàng)新性就不夠。但是跳出這個(gè)窠臼，從更高層面研究——從HIF1α轉(zhuǎn)到脂肪酸代謝，妥妥的高分文章。

苦惱于分子機(jī)制研究的科研狗們，不甘于發(fā)個(gè)低分文章的科研狗們，換個(gè)研究角度大膽的試一試吧！

參考文獻(xiàn)

1. Zhang Y, Kurupati R, Liu L, Zhou XY, Zhang G, Hudaihed A, Filisio F, Giles-Davis W, Xu X, Karakousis GC, Schuchter LM, Xu W, Amaravadi R, Xiao M, Sadek N, Krepler C, Herlyn M, Freeman GJ, Rabinowitz JD, Ertl HCJ. Enhancing CD8+ T Cell Fatty Acid Catabolism within a Metabolically Challenging TumorMicroenvironment Increases the Efficacy of Melanoma Immunotherapy. Cancer?Cell. 2017 Sep 11;32(3):377-391.e9. doi: 10.1016/j.ccell.2017.08.004.

2. Bailis W, Shyer JA, Chiorazzi M, Flavell RA.No Oxygen? No Glucose? No Problem: Fatty Acid Catabolism Enhances Effector CD8+?TILs.Cancer Cell. 2017 Sep 11;32(3):280-281. doi: 10.1016/j.ccell.2017.08.013.