圖1 |描繪各種惡性腫瘤中選擇的致癌融合基因的發(fā)現(xiàn)時(shí)間和用于檢測(cè)它們的方法。結(jié)構(gòu)重排及其后的基因融合首先在慢性骨髓性白血病患者中被發(fā)現(xiàn)，其中含有t（9; 22）（q34; q11）易位的腫瘤細(xì)胞容易從血液中獲得并用于細(xì)胞遺傳學(xué)分析。隨后在肉瘤（如t（11; 22）（q24; q12）和t（17; 22）（q22; q13））和癌組織中使用類似技術(shù)發(fā)現(xiàn)染色體間基因交換，導(dǎo)致易位。

用于檢測(cè)基因融合的技術(shù)隨著時(shí)間的推移而演變，包括多種檢測(cè)平臺(tái)方法，包括熒光原位雜交（FISH）和逆轉(zhuǎn)錄酶PCR（RT-PCR）分析，能夠檢測(cè)產(chǎn)生融合物的染色體內(nèi)事件（例如，那些導(dǎo)致EML4-ALK和KIF5B-RET融合的事件）。目前，采用無(wú)偏差的融合檢測(cè)技術(shù)，如NGS測(cè)序和anchored-multiplex PCR，可以在研究和臨床中檢測(cè)到越來(lái)越多的融合事件。 DFSP，皮膚纖維肉瘤。

激酶融合在原發(fā)腫瘤部位的分布。 融合基因的重排(能夠被靶向治療藥物所抑制）被認(rèn)為是具有臨床重要意義的驅(qū)動(dòng)基因事件。 圖中顯示了所選擇的臨床相關(guān)基因融合的分布，特別是涉及ALK，ROS1，RET，NTRK1 / 2/3，F(xiàn)GFR1 / 2/3和BRAF / CRAF在不同器官起源腫瘤的分布。 這些融合的頻率在不同腫瘤之間變化很大，從孤立病例報(bào)告到在大樣本報(bào)道的融合事件。 在惡性腫瘤中臨床相關(guān)基因融合的廣泛存在支持，提示有必要用basket方法（master protocal）來(lái)設(shè)計(jì)涉及靶向治療的臨床試驗(yàn)。

臨床中用于檢測(cè)基因融合的方法

盡管針對(duì)基因融合變異的腫瘤已經(jīng)有多個(gè)靶向藥物獲批，目前被FDA批準(zhǔn)作為“伴隨診斷”的診斷方法，僅限于對(duì)ALK，ROS1，BRAF的融合進(jìn)行診斷；其中包括用于ALK檢測(cè)的FISH，Ventana IHC，以及用于RSO1，BRAF診斷的NGS（Oncomine DX target Test，ThermoFisher）。

The panel, however, gauges alterations in 23 genes in total. The test report will not only indicate whether patients have ROS1, EGFR, and BRAF alterations linked to the three FDA-approved treatments, but also the presence or absence of variants in other genes

NGS能夠同時(shí)進(jìn)行多種驅(qū)動(dòng)基因檢測(cè)，但存在的問(wèn)題是往往需要數(shù)周的檢測(cè)周期（Turn around time),并且通常僅包括篩選出的外顯子Exons和少數(shù)已知的內(nèi)含子Introns，因此有可能無(wú)法檢測(cè)出新的融合類型變異。比較好的檢測(cè)流程，是先應(yīng)用IHC對(duì)ALK和ROS1進(jìn)行快速檢測(cè)，剩余標(biāo)本再進(jìn)行更廣的NGS測(cè)序。

基于血漿的液態(tài)活檢也被應(yīng)用于體細(xì)胞突變的檢測(cè)。比如分離血漿中的ctDNA進(jìn)行定量PCR（qPCR）或 hybridization capture based NGS檢測(cè)。但是qPCR需要在測(cè)序前獲知DNA斷裂點(diǎn)的信息，同樣，NGS能夠檢測(cè)出特定篩選的外顯子和內(nèi)含子以檢測(cè)融合，但前提是斷裂點(diǎn)正好要落在被篩選的區(qū)域中。需要注意的是，Introns通常較長(zhǎng)，現(xiàn)有的NGS panel往往會(huì)為了節(jié)約測(cè)序成本將其排除在外，這就意味著，很多融合類型將無(wú)法被檢測(cè)出來(lái)（ALK 和ROS1都存在許多不同的融合類型）。

對(duì)于在腫瘤中為發(fā)現(xiàn)驅(qū)動(dòng)基因（陰性）或高度懷疑存在融合基因變異但未必NGS檢出是，可以采用RNA 測(cè)序進(jìn)行檢測(cè)（anchored multiplex PCR），對(duì)比傳統(tǒng)的測(cè)序方法，對(duì)于未知的融合類型，基于RNA測(cè)序的檢測(cè)具有更大的優(yōu)勢(shì)。

Targets of tyrosine-kinase inhibitors

酪氨酸激酶抑制劑及其在體外抑制的蛋白質(zhì)總結(jié)如下（部分篩選）。 目標(biāo)列表不全面，這些藥物也可能會(huì)抑制本文未列出的其他蛋白質(zhì)。 這些被批準(zhǔn)或臨床測(cè)試的藥物中的大多數(shù)是除了下文描述的激酶之外還具有針對(duì)各種融合基因的一種或多種下游激酶配體的抑制活性。 值得注意的是，這些化合物的體外抑制作用在病例報(bào)告和/或臨床試驗(yàn)中并不都能轉(zhuǎn)化為臨床獲益。

針對(duì)激酶融合的藥物耐藥性的機(jī)制

針對(duì)激酶融合的藥物耐藥性的機(jī)制分為兩大類：“on target”改變，涉及融合本身的突變或擴(kuò)增；以及涉及激活并行旁路途徑的“off target”改變。 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在ATP-Binding site周圍 和solvent front 的獲得性耐藥突變?yōu)槟承┨囟ㄈ诤系鞍椎某Ｒ?jiàn)on-target耐藥機(jī)制。

 這些突變可以通過(guò)增加對(duì)ATP的親合力，通過(guò)改變?cè)诮Y(jié)合口袋中穩(wěn)定藥物所必需的氫鍵或引起空間干擾來(lái)阻礙藥物結(jié)合。

有趣的是，在不同的融合激酶中看到了趨同進(jìn)化 “convergent evolution”的現(xiàn)象，在不同的融合轉(zhuǎn)錄文本中觀察到了同源基因耐藥突變（上圖C所示，大部分ROS1，RET，TRKA，TRKB存在的耐藥突變與ALK中發(fā)現(xiàn)的耐藥突變?yōu)槠叫羞M(jìn)化同源基因）

激酶抑制劑對(duì)特定耐藥突變的抑制活性（in vitro）

激酶抑制劑對(duì)特定耐藥突變的抑制活性（in vitro）。怎對(duì)特定耐藥突變位點(diǎn)進(jìn)行激酶抑制劑的篩選用彩色圖表表示(綠色表示一個(gè)IC50 < 50 nM,黃色表示50 - 200nm的IC50,紅色代表的IC50 > 200nm)。

02

Fusions with approved /reported drugs

ALK融合是目前III期臨床實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)最豐富的融合驅(qū)動(dòng)基因，這條通路單藥治療的天花板不斷被被突破，ALEX一線超過(guò)25個(gè)月，是前所未有的勝利，同時(shí)PROFILE1014 長(zhǎng)期生存超過(guò)5年。這個(gè)領(lǐng)域的研發(fā)活力轉(zhuǎn)化成病人額長(zhǎng)期生存，沒(méi)有比這個(gè)更好的事情。

03

人類ROS1基因定位于6q21染色體，屬于酪氨酸激酶胰島素受體基因，編碼具有酪氨酸激酶活性的嵌合蛋白（RTK）。ROS1基因發(fā)生重排時(shí)丟失細(xì)胞外區(qū)域，保留跨膜區(qū)和胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)域，重排位點(diǎn)主要發(fā)生在ROS1基因的32~36 外顯子。

NSCLC中與ROS1重排的伙伴基因眾多，目前，在NSCLC患者及細(xì)胞株中已發(fā)現(xiàn)13個(gè)不同的ROS1 融合基因型，；在NSCLC中ROS1 基因主要與SLC34A2、CD74發(fā)生融合，并持續(xù)激活ROS1 酪氨酸激酶區(qū)及下游JAK/STAT、PI3K/AKT、RAS/MAPK等信號(hào)通路，進(jìn)而引起腫瘤的發(fā)生；

2014年11月，Alice shaw在NEJM上報(bào)道了I期臨床研究PROFILE1001中ROS1擴(kuò)大隊(duì)列的結(jié)果，數(shù)據(jù)來(lái)自50位入組的攜帶有ROS1融合的病例，crizotinib在這一人群出達(dá)到ORR72%和PFS19.2m可觀的長(zhǎng)期疾病控制時(shí)間。值得注意的是，在2015年JCO上發(fā)表的一項(xiàng)來(lái)自歐洲32例ROS1陽(yáng)性NSCLC回顧性分析提示，crizotinib的中位PFS為9.1m。

2016年ASCO上報(bào)道了一項(xiàng)克唑替尼治療ROS1晚期NSCLC的II期研究，納入了127例東亞患者，（中國(guó)患者 74 例）經(jīng) RT-PCR 確診的 ROS1 陽(yáng)性晚期NSCLC患者，結(jié)果提示整體患者和中國(guó)患者的 CR 分別為 11.0% 和 12.2%，PR 分別為 58.3% 和 56.8%，8 周疾病控制率為 88.2% 和 90.5%，中位首次緩解時(shí)間均為 1.9 月，中位無(wú)進(jìn)展生存為 13.4 個(gè)月和 12.9 個(gè)月。該研究結(jié)果與此前Alice T Shaw在2014年發(fā)表于NEJM的數(shù)據(jù)相一致，但由于歐洲的EUROS（中位PFS9.1m，2015JCO）

中國(guó)CFDA于2017年10月中旬批準(zhǔn)crizotinib用于ROS1陽(yáng)性NSCLC一線治療

 Ceritinib用于ROS1重排NSCLC: 一項(xiàng)韓國(guó)的II期臨床研究（NCT01964157）

2017年WCLC上報(bào)道了一項(xiàng)多激酶抑制劑Entrectinib（ROS1，TRK1/2/3）應(yīng)用于ROS1融合NSCLC的數(shù)據(jù)（來(lái)自STARTRK-2 (Phase 2), STARTRK-1 (Phase 1), and ALKA-372-001 (Phase 1) ）研究；在未經(jīng)TKI治療的ROS1-NSCLC中，Entrectinib達(dá)到86%ORR（12/14），中位PFS長(zhǎng)達(dá)29.6m。

對(duì)crizotinib的獲得性耐藥，已知的機(jī)制包括 ROS1 G2032R和D2033N突變，能夠被cabozantinib或Lorlatinib克服，目前已經(jīng)有臨床研究正在進(jìn)行。

Zou, H. Y. et al. PF-06463922 is a potent and selective next-generation ROS1/ALK inhibitor capable of blocking crizotinib-resistant ROS1 mutations. Proc. Natl Acad. Sci. USA 112, 3493–3498 (2015).
Drilon, A. et al. A novel crizotinib-resistant solvent-front mutation responsive to cabozantinib therapy in a patient with ROS1-rearranged lung cancer. Clin. Cancer Res. 22, 2351–2358 (2016).

Katayama, R. et al. Cabozantinib overcomes crizotinib resistance in ROS1 fusion–positive cancer. Clin. Cancer Res. 21, 166–174 (2015)

04

RET 基因位于10號(hào)染色體上，編碼屬于受體酪氨酸激酶（RTK）RET家族RTK的。RET重排在2012年被確認(rèn)為NSCLC的一種新的驅(qū)動(dòng)癌基因，發(fā)現(xiàn)于1-2%的NSCLC患者中 Nature Medicine 18, 378–381 (2012)，在年輕NSCLC（〈60y），不吸煙/少吸煙者中更常見(jiàn)。KIF5B-RET是主要融合型.（Drilon A et al. Lancet Oncol. 2016;17:1653-1660.）

在FDA已經(jīng)批準(zhǔn)的許多其他惡性腫瘤的藥物中，已經(jīng)被證明具有抗RET重排活性的有，凡德他尼，索拉菲尼，舒尼替尼，cabozantinib

一項(xiàng)研究Cabozantinib用于RET融合NSCLC的Phase II證實(shí)cabozantinib在這一人群的ORR為28%，中位PFS為7m。

一項(xiàng)在日本完成的Phase II，發(fā)現(xiàn)Vandetianib的有效率為53%，但有意思的是，一項(xiàng)來(lái)自韓國(guó)的補(bǔ)充數(shù)據(jù)顯示ORR僅有18%。

總而言之，對(duì)于RET融合NSCLC，已知的TKI抑制劑都僅僅表現(xiàn)出中度的活性（相比于ALK融合，和ROS1融合），為了獲得更大的臨床療效，仍然需要探索更有效的藥物或聯(lián)合方案。

不同融合類型對(duì)于腫瘤應(yīng)答的影響，在ALK融合和ROS1融合引起關(guān)注，同在，從2016年ASCO報(bào)道的RXDX105（Ignyta的另一個(gè)小分子抑制劑）的數(shù)據(jù)可以看出，KIF5B-RET融合對(duì)RXDX105缺乏應(yīng)答，而非KIF5B-RET融合的應(yīng)答率為83%。

05

·NTRK1 fusion originally identified in 19821,2 ·NTRK1 fusions first identified in NSCLC in 20133 ·MPRIP-NTRK1 and CD74-NTRK1 ·NTRK fusions <1% in NSCLC ·Oncogene fusions also involve NTRK2 and NTRK3 with multiple gene partners

2017年ASCO報(bào)道了一項(xiàng)關(guān)于basket-trial，在涵蓋了17種腫瘤類型攜帶TRK融合的患者驗(yàn)證了Larotrectinib的臨床療效，腫瘤應(yīng)答率達(dá)到76%，中位PFS仍未達(dá)到，2017年5月12日FDA授予Larotrectinib在NTRK融合惡性腫瘤中的“Orphan drug designation “的稱號(hào)。

在 AACR 2016年會(huì)上報(bào)告的兩項(xiàng)研究——STARTRK-1 研究和 ALKA-372-001 研究的數(shù)據(jù)顯示，Entrectinib 治療多種融合基因?qū)嶓w瘤患者均顯示出了可觀的療效，客觀緩解率達(dá)到79%，并對(duì)原發(fā)性腦瘤和腦轉(zhuǎn)移表現(xiàn)出良好的效果。

目前，已啟動(dòng)更大樣本量的STARTRK-2 II期研究（basket trial)，以證實(shí)在STARTRK-1和ALKA-1試驗(yàn)中所觀察到的研究結(jié)果。STARTRK-2 II期研究納入了NTRK1/2/3、ROS-1和ALK重排患者。

06

過(guò)去幾十年來(lái)，在精準(zhǔn)腫瘤學(xué)領(lǐng)域取得了巨大進(jìn)步。

融合型驅(qū)動(dòng)基因的檢測(cè)技術(shù)和藥物研發(fā)，包括含有ALK和ROS1的融合蛋白是最成功的例子之一，這兩個(gè)領(lǐng)域的進(jìn)展足可以成為驅(qū)動(dòng)基因理念的佐證。大規(guī)模測(cè)序工作已經(jīng)確定了幾種癌癥的罕見(jiàn)致癌融合。重要的是，許多這些融合已被證明是可被靶向的目標(biāo)，或者具有極佳的研究前景。在某些情況下，與存在在相同基因上的點(diǎn)突變相比（如FGFR2 / 3），已經(jīng)證明基因融合對(duì)靶向治療具有更高的敏感性。由于幾種致癌融合的出現(xiàn)率低，在典型的I / II期試驗(yàn)中臨床進(jìn)行試驗(yàn)似乎是不切實(shí)際的。設(shè)計(jì)針對(duì)具有特定遺傳異常的患者的籃子試驗(yàn)，無(wú)論組織學(xué)或腫瘤類型如何，提供了一種有效的方法來(lái)研究這些罕見(jiàn)改變的臨床意義。

Schram, A. M. et al. (2017) Fusions in solid tumours: diagnostic strategies, targeted therapy, and acquired resistance

Nat. Rev. Clin. Oncol. doi:10.1038/nrclinonc.2017.127