1986年，美國FDA批準了第一個單克隆抗體藥物上市，距今已快30年。目前，全世界共有超過40個治療用抗體藥物被批準上市，每年實現(xiàn)超過600億美元的銷售額。在國際及國內(nèi)形成了抗體藥物開發(fā)熱潮。巨大的市場前景和現(xiàn)存的技術問題及壁壘并存的現(xiàn)實不可避免地引發(fā)抗體藥物新一輪技術革命。而其結果又將毫無疑問地改變抗體藥物的市場格局。

但是，抗體不管是作為檢測試劑，還是作為具有巨大市場前景的治療藥物。首先，我們都需要通過篩選找到單克隆抗體。傳統(tǒng)的單克隆抗體制備方法主要是雜交瘤技術。這是目前比較成熟，技術難度比較低，大多數(shù)實驗室仍然在使用的方法。

在單克隆抗體制備過程中，有兩次篩選過程，第一次是使用選擇性培養(yǎng)基選出雜交瘤細胞；第二次就是進一步選出能產(chǎn)生我們需要的抗原特異性抗體的雜交瘤細胞。

利用雜交瘤技術制備單克隆抗體的基本原理是根據(jù)以下三個原則：

1、一種淋巴細胞克隆只產(chǎn)生一種抗體；

2、細胞融合技術產(chǎn)生的雜交瘤細胞可以保持雙方親代細胞的特性；

3、利用代謝缺陷補救機理篩選出雜交瘤細胞，并進行克隆化，然后大量培養(yǎng)增殖， 制備所需的單克隆抗體。

第一次篩選的原理和方法：

細胞融合后，雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng)是第一次篩選的關鍵。普遍采用的HAT選擇性培養(yǎng)液是在普通的動物細胞培養(yǎng)液中加入次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷酸。其依據(jù)是細胞中DNA的合成有兩條途徑：

一條途徑是生物合成途徑(D途徑)，即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，為DNA分子的合成提供原料。在此合成過程中，葉酸作為重要的輔酶參與這一過程，而HAT培養(yǎng)液中氨基蝶呤是一種葉酸的拮抗劑，可以阻斷DNA合成的“D途徑”。

另一條途徑是應急途徑或補救途徑(S途徑)，它是利用次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核苷轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)催化次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相應的核苷酸，兩種酶缺一不可。

因此，在HAT培養(yǎng)液中，未融合的B細胞及兩個B細胞的融合產(chǎn)物的D途徑被氨基蝶呤阻斷，雖S途徑正常，但因缺乏在體外培養(yǎng)液中的增殖能力，一般在10天左右會死亡。對于骨髓瘤細胞以及自身融合細胞而言，由于通常采用的骨髓瘤細胞是次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核苷轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)缺陷細胞，因此自身沒有S途徑，且D途徑又被氨基蝶呤阻斷，所以在HAT培養(yǎng)液中也不能增 殖而很快死亡。只有骨髓瘤細胞與B細胞相互融合的雜交瘤細胞，既具有B細胞的S途徑，又具有骨髓瘤細胞在體外培養(yǎng)液中長期增殖的特性，因此能在HAT培養(yǎng)液中選擇性存活下來，并不斷增殖。

第二次篩選的原理和方法：

在單克隆抗體的生產(chǎn)過程中，由于B淋巴細胞的特異性是不同的，經(jīng)HAT培養(yǎng)液第一次篩選出的雜交瘤細胞產(chǎn)生的抗體存在多樣性，必須對雜交瘤細胞群進行第二次篩選，才能選出針對目標抗原具有特異性的雜交瘤細胞。二次篩選通常采用有限稀釋法，將雜交瘤細胞多陪稀釋，接種在多孔細胞培養(yǎng)板上，使每孔不超過一個細胞，通過培養(yǎng)讓其增值。然后檢測各孔上清液中細胞分泌的抗體的特異性(常用ELISA方法)，上清液可與特定抗原結合的培養(yǎng)孔為陽性孔。陽性孔中細胞還不能保證是來自單個細胞，需要繼續(xù)進行有限稀釋，一般重復3-4次，直至確信每個孔中增值的細胞為單克隆細胞。第二次篩選也是鑒定特異性親和力的過程。

有限稀釋法對于篩選雜交瘤來說，是最普通的方法，在許多實驗室中都在使用。但是，作為相對舊的技術，已經(jīng)不能滿足當今的需求。方法自身具有許多缺點：

1、人工操作，操作及重復的步驟太多，不可避免容易出錯。

2、速度慢，效率低。只能保證30-40%的孔有細胞生長。對于高通量篩選來說，不能滿足要求。

3、不能保證單克隆，需要亞克隆3-4次，所以，人工和耗時都較多。

4、有限稀釋在ELISA檢測前，并不知道哪一個克隆滿足抗原特異性的要求。所以，需要對所有克隆，都要最少做一次ELISA鑒定。

除了有限稀釋方法，現(xiàn)在相對先進的細胞分選技術也得到普遍應用。一般就是細胞分選儀或者流式細胞技術對雜交瘤細胞進行篩選。其原理是先將細胞分散開，沒有細胞結團。通過在細胞表面或細胞內(nèi)標記熒光信號。當單個細胞在壓力作用下單個通過玻璃毛細管的時候，儀器可以自動檢測單個細胞的熒光信號強度。熒光信號強度反應這個細胞的相應抗體表達水平。最后，將高熒光信號強度的細胞收集，再通過有限稀釋得到高水平表達的單克隆；或者也可以使用單細胞收集器收集高水平表達的單個雜交瘤細胞。

細胞分選或者流式細胞技術的篩選原理如下圖所示：

這種技術也在很多實驗室中使用，但是根據(jù)其篩選原理，有一些不可避免的缺陷。

1、由于必須要對細胞表面或內(nèi)部使用熒光標記，所以，一般主要使用于胞內(nèi)表達的蛋白或者膜表達蛋白。對于分泌表達的雜交瘤細胞來說，使用具有局限性。

2、具體檢測的是單個細胞在某個時間點的熒光強度。所以，檢測結果容易受細胞周期的影響。而且，單個細胞的表達水平也不能很好反應后期生產(chǎn)階段細胞群體的表達水平。

3、流式篩選技術只是對熒光信號強的所有細胞作出劃分，后期需要復篩的細胞數(shù)目仍然很多，下游工作量仍然比較大。

4、由于對單個細胞使用壓力操作，剪切力會降低細胞存活率。所以，低成活率也成為這個技術的一個主要缺陷。

5、流式篩選需要對管路系統(tǒng)充分清洗消毒才能確保細胞不會污染，污染的風險較高。

隨著技術進步，我們也迫切需要一種更先進的篩選技術。能夠滿足高通量，自動化，高效率的要求?，F(xiàn)在，一種新的雜交瘤篩選技術平臺Clonepix2技術已經(jīng)出現(xiàn)，并且在世界范圍內(nèi)得到廣泛使用，實踐證明其能夠大大加快雜交瘤篩選速度，并且提高效價，降低成本。其篩選原理如下：

1、使用半固體培養(yǎng)的方法，使細胞在培養(yǎng)基上生長成單個獨立分散的單克?。话牍腆w培養(yǎng)基可以阻止克隆移動，保證篩選到的克隆是單克隆。

2、在半固體培養(yǎng)基中加入熒光標記克隆檢測試劑?？寺z測試劑、營養(yǎng)因子以及克隆表達的蛋白分子都可以自由在半固體培養(yǎng)基中擴散。當熒光標記檢測試劑捕獲目標蛋白分子后，形成分子復合體。復合體大分子聚集在克隆的周圍。而且，隨著克隆生長時間延長，聚集更多熒光蛋白復合體。

3、軟件在白光下識別細胞克隆，在熒光下對克隆的熒光水平進行定量。并且，機械臂及挑頭可以自動化挑取熒光水平高的細胞克隆到96孔微孔板。

作為最新一代技術，Clonepix2技術在篩選雜交瘤方面具有許多優(yōu)點：

1、第一次將克隆的篩選自動化，可以更少時間，篩選更多克隆。

2、篩選雜交瘤效率高。由于篩選過程以及挑克隆的自動化，可以在短時間內(nèi)篩選大量克隆，所以大大提高找到稀少的高產(chǎn)克隆的概率。

3、高效率也大大減少人力，增加雜交瘤篩選的通量，同一時間可以運作更多項目。

4、由于快速篩選更高水平克隆用于下游生產(chǎn)，同時盡可能早的丟棄掉低產(chǎn)的克隆，將目標專注于稀少的高產(chǎn)克隆，也避免了有限稀釋，大大減少下游生產(chǎn)成本；同時節(jié)省耗材。

作為雜交瘤篩選的最新技術，也存在一些缺點。比如，首先雜交瘤要能在半固體培養(yǎng)基上生長良好，所以，合適的培養(yǎng)基就尤為重要。其次，克隆的大小和密度對于自動化挑取克隆的精確性有很大影響?？寺√?，會影響識別和挑取?？寺√?，容易影響挑到克隆的單克隆性。最后，機械臂對于挑選精度要求比較高，所以，設備的日常維護就非常重要。

在抗體藥物快速發(fā)展的今天，技術進步對于快速篩選到特異性的雜交瘤就顯得非常重要，可以大大加快篩選進程，縮短抗體藥物從研發(fā)到臨床及生產(chǎn)上市的周期。對于抗體行業(yè)的快速發(fā)展將起到不可缺少的推動作用。