焦磷酸測序 技術(shù)(pyrosequencing)是一種新型的酶聯(lián)級聯(lián)測序技術(shù)，焦磷酸測序法適于對已知的短序列的測序分析，其可重復(fù)性和精確性能與SangerDNA測序法相媲美，而速度卻大大的提高。焦磷酸測序技術(shù)產(chǎn)品具備同時對大量樣品進(jìn)行測序分析的能力，為大通量、低成本、適時、快速、直觀地進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性(single nucle—otide potymorphisms，SNPs)研究和臨床檢驗提供了非常理想的技術(shù)操作平臺。該技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)后可以滿足上百個核苷酸序列的測序工作， 這樣該技術(shù)又可以滿足對重要微生物的鑒定與分型，特定DNA片段的突變檢測和克隆鑒定等方面的應(yīng)用。 1.焦磷酸測序 技術(shù)原理 焦磷酸測序 技術(shù)是由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。焦磷酸測序技術(shù)的原理是：引物與模板DNA退火后，在DNA聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfurytase).熒光素酶(1uciferase)和三磷酸腺苷雙磷酸酶(Apyrase)4種酶的協(xié)同作用下，將引物上每一個dNTP的聚合與一次熒光信號的釋放偶聯(lián)起來，通過檢測熒光的釋放和強(qiáng)度，達(dá)到實時測定DNA序列的目的。焦磷酸測序技術(shù)的反應(yīng)體系由反應(yīng)底物、待測單鏈、測序引物和4種酶構(gòu)成。反應(yīng)底物為5’-磷酰硫酸(adenosine- 5’-phosphosulfat，APS)、熒光素(1uciferin)。 2.焦磷酸測序 技術(shù)的反應(yīng)過程 在每一輪測序反應(yīng)中，反應(yīng)體系中只加入一種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)。如果它剛好能和DNA模板的下一個堿基配對，則會在DNA聚合酶的作用下，添加到測序引物的3’末端，同時釋放出一個分子的焦磷酸(PPi)。在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS結(jié)合形成ATP,在熒光素酶的催化下，生成的ATP又可以和熒光素結(jié)合形成氧化熒光素，同時產(chǎn)生可見光。通過微弱光檢測裝置及處理軟件 可獲得一個特異的檢測峰，峰值的高低則和相匹配的堿基數(shù)成正比。如果加入的dNTP不能和DNA模板的下一個堿基配對，則上述反應(yīng)不會發(fā)生，也就沒有檢測峰。反應(yīng)體系中剩余的dNTP和殘留的少量ATP在Apyrase的作用下發(fā)生降解。待上一輪反應(yīng)完成后，加入另一種dNTP，使上述反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行，根據(jù)獲得的峰值圖即可讀取準(zhǔn)確的DNA序列信息。 3.焦磷酸測序技術(shù)基因分析上的應(yīng)用 焦磷酸測序技術(shù)可以用來研究單核苷酸多態(tài)性(single ucleotide polymor—phism，SNP)，遺傳多態(tài)性，植物多態(tài)性分析，分子診斷細(xì)菌與病毒分型、甲基化分析、法醫(yī)鑒定及藥物基因組學(xué)等方面都有廣泛的應(yīng)用。該技術(shù)不需要凝膠電泳，也不需要對DNA樣品進(jìn)行任何特殊形式的標(biāo)記和染色，具有大通量、低成本、快速、直觀的特點。與Sanger測序法相比，焦磷酸測序技術(shù)有其特定的優(yōu)勢，已經(jīng)成為DNA分析研究的重要手段。目前已經(jīng)有很多關(guān)于該技術(shù)在分子生物學(xué)上的應(yīng)用研究，而且隨著技術(shù)的不斷成熟和改進(jìn)，在實踐中的應(yīng)用將越來越廣泛。Jonasson等運用焦磷酸測序技術(shù)通過檢測病原菌16S rRNA基因，快速鑒定臨床標(biāo)本中抗生素抵抗菌;Monstein等用焦磷酸測序技術(shù)檢測幽門螺桿菌16S rRNA基因(16S rDNA)易變的Vl和V3區(qū)序列，證明該技術(shù)可滿足對臨床病原菌標(biāo)本的快速鑒定和分型;Unnerstad等利用該技術(shù)對106株不同血清型的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌進(jìn)行了分型，在短時間內(nèi)完成大量的樣本測序，其并行性和高效率非常顯著，如果用常規(guī)的測序技術(shù)，工作量會很大。Gharizadeh等人用此技術(shù)對67個人乳頭瘤病毒(HPV)樣品進(jìn)行了鑒定和分型，結(jié)果證明該技術(shù)也非常適于HPV等病原體的大規(guī)模鑒定、分型和突變的研究。瑞典Uppsala大學(xué)利用焦磷酸測序技術(shù)建立了新的鑒定炭疽熱細(xì)菌(Bacillus anlhracis)及其致病狀態(tài)的方法，他們利用此技術(shù)分析染色體上的Ba813基因(此基因長度為277bp，在染色體上為單拷貝是炭疽熱桿菌區(qū)別于其他土壤桿菌的標(biāo)志)20bp的特異序列來鑒定炭疽熱細(xì)菌.準(zhǔn)確率達(dá)99.6 %，通過分析菌株是否含有兩個質(zhì)粒(鑒定pX0l的lef基因和pX02的cap基因)來確定炭疽熱細(xì)菌的致病狀態(tài).準(zhǔn)確率達(dá)100‰。Edvinsson B等應(yīng)用焦磷酸測序技術(shù)對T弓形體蟲的三個亞型進(jìn)行區(qū)分，采用real-time PCR技術(shù)擴(kuò)增出目的片段，在此基礎(chǔ)上運用焦磷酸測序技術(shù)測定GRA6基因中兩個單核甘酸多態(tài)性確定其分型,該技術(shù)對典型蟲株的準(zhǔn)確率達(dá)到100%,對包括非典型性蟲株的分型準(zhǔn)確率也達(dá)到81%。該技術(shù)還被應(yīng)用于百日咳桿菌(Bordetella pertussis)與副百日咳桿菌(Parapertussis) 等細(xì)菌的快速鑒定及分型。 在國內(nèi)，該技術(shù)應(yīng)用受到越來越多研究者的重視。趙錦榮等，首先運用PCR擴(kuò)增含耐藥決定區(qū)一297 bp長的rpoB基因片段，借用鏈親和素包被磁珠純化單鏈PCR產(chǎn)物，設(shè)計2個正向測序引物，運用pyrosequen cing技術(shù)對耐藥決定區(qū)進(jìn)行序列測定.通過對一系列10倍稀釋的結(jié)核分枝桿菌H，R標(biāo)準(zhǔn)株DNA進(jìn)行分析，評價所建立方法的檢測特異性.結(jié)果：PCR擴(kuò)增后，可在2 h內(nèi)得到耐藥決定區(qū)序列.所建立方法的檢測靈敏度為50 fg DNA/反應(yīng).在所分析的利福平敏感株中均未檢測到耐藥決定區(qū)突變，而在耐利福平菌株中均檢測到耐藥決定區(qū)突變.所建立的方法具有自動化程度高和結(jié)果準(zhǔn)確等特點，適用于對耐利福平結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行快速高通量檢測。程紹輝等，從感染人SARS病毒的Vero-6細(xì)胞中提取病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，PCR擴(kuò)增目的基因片段，采用焦磷酸測序技術(shù)(Pyro- sequencing Technology，PSQ)進(jìn)行第2601、7919、9479、119838多個堿基突變位點測序和突變頻率分析。通過測序分析多個可能出現(xiàn)突變的位點，確定了該病毒為北京流行株，同時發(fā)現(xiàn)第7919位堿基發(fā)生了A/G突變。宋家武等應(yīng)用該技術(shù)建立了高通量測定乙型肝炎病毒YMDD突變區(qū)的方法，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)的YMDD突變質(zhì)粒及血清標(biāo)本的重復(fù)性及可靠性檢測，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的突變檢出率及重復(fù)率均達(dá)100%，而血清標(biāo)本達(dá)98.8%。 另外，在法醫(yī)鑒定，以及SNP分析上都有應(yīng)用該技術(shù)的研究報道，并且可以起到快速，準(zhǔn)確的效果。在動物如豬的多態(tài)性分析研究中，Milan等 利用焦磷酸測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)豬骨骼肌糖原含量增高與PRKAG3基因的一個不可逆轉(zhuǎn)的堿基置換相關(guān)，該基因編碼豬肌肉特異性的腺苷單磷酸激活的蛋白激酶異構(gòu)體的調(diào)節(jié)亞單位。 優(yōu)點： 1.不需要制膠，不需要毛細(xì)管，也不需要熒光染料和同位素。 2.10分鐘內(nèi)可分析96個樣品的SNP,可滿足高通量分析的要求。 3.每個樣品孔都可進(jìn)行獨立的測序或SNP分析，實驗設(shè)計靈活。 4.序列分析簡單，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。 |
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