建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測胃癌患者血清循環(huán)長鏈非編碼RNA HULC的方法及其意義*董業(yè)峰1**，金春景2，申嫻娟3，鞠少卿2，3 （1海安縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 226600；南通大學(xué)附屬醫(yī)院2醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，3外科綜合實(shí)驗(yàn)室） [摘要] 目的：建立基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR）檢測血清循環(huán)長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）HULC的方法，應(yīng)用該技術(shù)檢測胃癌、胃息肉患者及正常人血清HULC的表達(dá)水平，探討血清HULC檢測在胃癌輔助診斷中的價(jià)值。方法：采集經(jīng)病理確診的110例初診胃癌患者、30例胃息肉患者的血清標(biāo)本，與110例正常人血清標(biāo)本進(jìn)行對比，采用RT-qPCR方法檢測HULC的相對表達(dá)量。結(jié)果：RT-qPCR方法檢測循環(huán)HULC穩(wěn)定可靠、線性良好、批內(nèi)變異系數(shù)為2.89%、批間變異系數(shù)為4.85%。初診胃癌患者血清HULC表達(dá)水平為2.423±0.326，顯著高于胃息肉組的1.105±0.102和正常對照組的0.901±0.068，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.01），而胃息肉組和正常對照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。以血清HULC相對表達(dá)量1.4525作為診斷初診胃癌患者和正常對照者的臨界值，其ROC曲線下面積為0.888（95% CI 0.843～0.934），明顯高于CEA 0.694（95%CI 0.621～0.737）和CA72-4 0.514（95% CI 0.433～0.595）。結(jié)論：實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種簡便、特異性好的檢測循環(huán)HULC的方法，檢測血清中循環(huán)HULC濃度對胃癌早期輔助診斷有一定的價(jià)值。
[關(guān)鍵詞] 胃癌；長鏈非編碼RNA；HULC 胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，致死率位于全球惡性腫瘤的第二位[1]，東亞和拉美為胃癌高發(fā)區(qū)，特別是中國。由于早期診斷困難，治療方法局限，且易發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，胃癌仍是現(xiàn)代臨床診療面臨的巨大挑戰(zhàn)[2]。雖然胃鏡技術(shù)能提高胃癌早期診斷率，但不少患者對該檢查依從性差，超過50%的患者初次診斷時(shí)已進(jìn)入進(jìn)展期，致使胃癌5年生存率低于30%[3]。因而提高胃癌的早期診斷對患者及時(shí)治療及改善預(yù)后尤為重要。 目前，CEA和CA72-4是胃癌診斷中應(yīng)用較為廣泛的腫瘤標(biāo)志物，有一定的價(jià)值，但敏感性和特異性較低嚴(yán)重阻礙它們的臨床應(yīng)用[4-5]。因此，積極尋找侵入性小、穩(wěn)定性佳、既敏感又特異的胃癌腫瘤標(biāo)志物對胃癌早期診斷、預(yù)后判斷、病程監(jiān)測十分必要。 長鏈非編碼RNA（lncRNA）是長度超過200個(gè)核苷酸且無蛋白編碼功能的RNA分子，在表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，廣泛參與機(jī)體生理和病理過程，在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色[6]。因lncRNA組織特異性高，二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，有望成為新型生物標(biāo)志物。HULC（high upregulated in liver cancer）首先在肝癌組織發(fā)現(xiàn)高表達(dá)，后又發(fā)現(xiàn)在其他消化系統(tǒng)腫瘤中亦發(fā)揮重要致癌作用。本實(shí)驗(yàn)擬采用熒光定量PCR技術(shù)檢測血清中循環(huán)HULC，比較胃癌良、惡性腫瘤患者及正常人血清HULC的表達(dá)差異，探討其在胃癌輔助診斷中的價(jià)值。 1 資料與方法1.1 一般資料選擇2013年8月～2015年11月南通大學(xué)附屬醫(yī)院和海安縣人民醫(yī)院經(jīng)病理確診的110例胃癌初診患者，其中男性61例，女性49例，年齡44～80歲；胃息肉患者30例，其中男性16例，女性14例，年齡43～81歲；同期門診體檢健康者110例，其中男性63例，女性47例，年齡43～80歲。收集受試者的血液標(biāo)本。本研究經(jīng)院倫理委員會批準(zhǔn)，在抽血前均得到受試者的知情同意。 1.2 血液標(biāo)本采集和血清總RNA的提取采用分離膠的真空采集管收集受試者的血液標(biāo)本，以1 000 r/min離心10min后，將上層血清分裝于無酶離心管中，置于-80℃保存?zhèn)溆?。采用血清RNA提取試劑盒（美國生命技術(shù)公司）提取血清總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測量濃度和純度合格后，立即保存于-80℃。 1.3 RNA逆轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)DNA采用逆轉(zhuǎn)錄試劑（美國賽默飛公司）將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA。逆轉(zhuǎn)錄體系：RNA10μL，5×反應(yīng)緩沖液4μL，逆轉(zhuǎn)錄引物2μL，脫氧核糖核苷酸2μL，核糖核酸酶抑制劑1μL，逆轉(zhuǎn)錄酶1μL，無核酸酶純水補(bǔ)足至20μL。將上述體系混勻，瞬時(shí)離心。反應(yīng)條件：42℃60min，70℃5min。合成的互補(bǔ)DNA置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p> 1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測微HULC水平采用Fast Start Universal SYBR GreenⅠMaster（PCR反應(yīng)混合物，德國羅氏公司）和7500實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增儀（美國ABI公司）進(jìn)行熒光定量PCR檢測。取3μL cDNA采用相對定量的方法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。每次PCR反應(yīng)時(shí)另取由60例正常人混合血清為對照血清，作為每次反應(yīng)的參比，計(jì)算相對表達(dá)量。HULC的上游引物5'-TCATGATGGAATTGGAGCCTT-3'，HULC下游引物5'-CTCTTCCTGGCTTGCAGATTG-3'；GAPDH上游引物5'-CCCTTCATTGACCTCAACTA-3'，GAPDH下游引物5'-TGGAAGATGGTGATGGGATT-3'。反應(yīng)體系：SYBR GreenⅠ混合液10μL，cDNA3μL，正向引物1μL，反向引物1μL，無RNA酶水5μL。混勻以上體系，瞬時(shí)離心。反應(yīng)條件為95℃10min；95℃15 s，60℃30 s，72℃30 s，40個(gè)循環(huán)；60℃～95℃收集熒光，通過熔解曲線及2%瓊脂糖凝膠電泳評估PCR反應(yīng)的特異性。 1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，Graphpad Prism 5軟件用來繪圖。各組血清HULC相對表達(dá)量以RQ值的Mean±SE表示，兩獨(dú)立樣本比較采用雙側(cè)Test檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2 結(jié)果2.1 質(zhì)量控制 2.1.1 線性：將混合對照血清cDNA進(jìn)行10倍梯度稀釋后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。HULC標(biāo)準(zhǔn)曲線算得Y=-3.047X+21.95，R2=0.9949；GAPDH的標(biāo)準(zhǔn)曲線算得Y=-3.437X+18.59，R2=0.9998；依據(jù)擴(kuò)增效率公式E%=（10-1/斜率-1）×100%，計(jì)算得出該法擴(kuò)增效率為EHULC%=113.12.%、EGAPDH%=95.43%，說明該檢測方法線性良好，可以檢測血清中不同濃度的HULC，見圖1。  圖1 HULC和GAPDH擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線 2.1.2 重復(fù)性：將同一份混合血清參照品同一批次進(jìn)行20個(gè)平行孔檢測HULC和GAPDH，統(tǒng)計(jì)Ct值，計(jì)算批內(nèi)CV；將混合血清等分成20份，每天1份，連續(xù)檢測20天，統(tǒng)計(jì)Ct值，測得批間CV，見表1。HULC批內(nèi)CV為2.89%、批間CV為4.85%；GAPDH批內(nèi)CV為0.82%、批間CV為4.85%。以上結(jié)果顯示該方法具有較好的重復(fù)性。  圖2 HULC和GAPDH特異性 表1 HULC和GAPDH批內(nèi)、批間重復(fù)性  HULC GAPDH批內(nèi)Mean±SE 32.25±0.2944 30.20±0.0785 CV（%）2.89%0.82%批間Mean±SE 32.88±0.5039 30.76±0.2323 CV（%）4.85%4.85% 2.1.3 特異性：由圖2A可見，熒光定量PCR熔解曲線呈平滑單峰，HULC、GAPDH熔解溫度分別為78.03℃和81.23℃。由圖2B可見，在2%瓊脂糖凝膠電泳中，HULC、GAPDH條帶明亮單一。由圖2C可見，PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，結(jié)果符合人類基因庫中HULC的序列。說明該方法特異性較好。 2.1.4 穩(wěn)定性：將混合血清平均分成個(gè)6等分，每3個(gè)等分分別進(jìn)行室溫下孵育0、6、12、18，24h和反復(fù)凍融0、1、3、5、10次處理，結(jié)果顯示循環(huán)HULC在嚴(yán)苛條件下仍具有相對穩(wěn)定性。見圖3。 2.2 胃癌、胃息肉患者與正常對照組血清HULC表達(dá)水平用上述建立的方法，對110例初診胃癌患者、30例胃息肉患者和110例正常對照者血清HULC進(jìn)行檢測。初診胃癌患者血清HULC的相對表達(dá)水平為2.423±0.326，顯著高于胃息肉患者1.105±0.102和正常對照者0.901±0.068，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.01），而胃息肉和正常對照者比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。見圖4。
 圖3 循環(huán)HULC和GAPDH穩(wěn)定性  圖4 胃癌初診、胃息肉患者與正常對照組相對表達(dá)量 2.3 血清HULC及CEA、CA72-4水平對初診胃癌患者診斷效能的比較ROC曲線是將診斷試驗(yàn)的結(jié)果劃分為若干個(gè)臨界點(diǎn)，以每個(gè)臨界點(diǎn)對應(yīng)的“1-特異度”為橫坐標(biāo)，敏感度為縱坐標(biāo)作圖得出的曲線。ROC曲線下面積包含了診斷試驗(yàn)多個(gè)臨界點(diǎn)的敏感度、特異度，較為全面反映診斷試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，是臨床常用的評估診斷效能的方法。我們對100例初診胃癌患者和110例正常人血清HULC及CEA、CA72-4水平進(jìn)行檢測，并結(jié)合正常對照組作ROC曲線（圖5）。HULC取診斷臨界值為1.4525時(shí)，ROC曲線下面積為0.888（95%CI 0.843～0.934，P< 0.001）；cea取診斷臨界值為5="" ng/ml時(shí)，roc曲線下面積為0.694（95%ci=""><0.001）；ca72-4取診斷臨界值為10 u/ml時(shí)，roc曲線下面積為0.514（95%ci="" 0.433～0.595，p="">  圖5 初診胃癌組區(qū)分于正常對照時(shí)各指標(biāo)的ROC曲線 3 討論人類全基因組分析顯示基因組中僅有不到2%的序列能夠編碼出有生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)，而超過90%的序列被轉(zhuǎn)錄成非編碼RNA[7-8]，其中長鏈非編碼RNA是分子生物學(xué)領(lǐng)域新近的研究熱點(diǎn)。大量的文獻(xiàn)表明lncRNA廣泛參與各種生理病理過程，包括細(xì)胞分化、染色體修飾、免疫反應(yīng)和疾病狀態(tài)。更有意思的是，lncRNA具備作為新型臨床診斷標(biāo)志物和治療新靶點(diǎn)的潛力。PCA3是新型標(biāo)志物的典型代表，臨床上非侵入性方式檢測PCA3轉(zhuǎn)錄本在診斷前列腺癌方面優(yōu)于傳統(tǒng)的蛋白指標(biāo)前列腺抗原（PSA），具有理想的靈敏度和特異度[9]。Arita等[10]證實(shí)在胃癌患者血漿中存在lncRNA H19，Shao等[11]發(fā)現(xiàn)胃液中同樣存在異常表達(dá)的lncRNA AA174084。這些研究為循環(huán)lncRNAs的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。 本研究建立了一種靈敏、特異、穩(wěn)定的SYBR Green I熒光定量PCR檢測血清循環(huán)HULC的方法，應(yīng)用該方法同時(shí)檢測110例初診胃癌患者、30例胃息肉患者和110例正常對照者血清中循環(huán)HULC表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，初診胃癌患者血清HULC相對表達(dá)水平為2.423±0.326，顯著高于胃息肉患者1.105±0.102和正常對照者0.901±0.068，胃息肉患者和正常對照者的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義異。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)以血清循環(huán)HULC相對含量1.4456、CEA水平5 ng/mL和CA72-4水平10 U/mL作為診斷臨界值，ROC曲線下面積分別為0.888、0.694和0.514，提示血清循環(huán)HULC的診斷效能優(yōu)于CEA和CA72-4，在胃癌輔助診斷方面具有一定的臨床價(jià)值。 綜上所述，熒光定量PCR方法能夠靈敏特異地檢測血清中循環(huán)HULC表達(dá)水平，血清中循環(huán)HULC可作為胃癌輔助診斷的良好指標(biāo)。我們的工作還只是初步研究，大樣本收集、長期隨訪和進(jìn)一步的功能研究還需加強(qiáng)，以進(jìn)一步驗(yàn)證胃癌患者血清HULC在臨床分期、病理進(jìn)程等方面的臨床應(yīng)用前景。 [參考文獻(xiàn)] [1]Ang TL，F(xiàn)ock KM.Clinical epidemiology of gastric cancer［J］.Singapore Med J，2014，55（12）：621-628. [2]Yang F，Bi J，Xue X，et al.Up-regulated long non-coding RNA H19 contributes to proliferation of gastric cancer cells［J］.FEBS J，2012，279（17）：3159-3165. [3]Siegel RL，Miller KD，Jemal A.Cancer statistics，2016［J］. CA Cancer JClin，2016，66（1）：7-30. [4]Rehena Z，Ghosh CK，Afroz F，et al.Comparison of serum CA72-4 and CEA levels in patient with Endoscopically Suspected Gastric Carcinoma［J］.Mymensingh Med J，2015，24（3）：542-549. [5]Jing JX，Wang Y，Xu XQ，et al.Tumor markers for diagnosis，monitoring of recurrence and prognosis in patients with upper gastrointestinal tract cancer［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2014，15（23）：10267-10272. [6]Bhan A，Mandal SS.Long noncoding RNAs:emerging stars in gene regulation，epigenetics and human disease［J］.Chem Med Chem，2014，9（9，SI）：1932-1956. [7]Djebali S，Davis CA，Merkel A，et al.Landscape of transcription in human cells［J］.Nature，2012，489（7414）：101-108. [8]Ponting CP，Belgard TG.Transcribed dark matter:meaning or myth［J］?Hum Mol Genet，2010，19（R2）：R162-R168. [9]Locke JA，Black PC.Next Generation biomarkers in prostate cancer［J］.Front Biosci（Landmark Ed），2016，21:328-342. [10]Arita T，Ichikawa D，Konishi H，et al.Circulating long noncoding RNAs in plasma of patients with gastric cancer［J］. Anticancer Res，2013，33（8）：3185-3193. [11]Shao Y，Ye M，Jiang X，et al.Gastric juice long noncoding RNA used as a tumor marker for screening gastric cancer［J］.Cancer，2014，120（21）：3320-3328. The establishment of quantitative real-time polymerase chain reaction about circulating long non-coding RNA HULC in serum of gastric cancer patients and its clinical significance DONG Yefeng1,JIN Chunjing2,SHEN Xianjuan3,JU Shaoqing2，3 [Abstract] Objective:To establish amethod by using quantitative real-time PCR(RT-qPCR)for detecting circulating long non-coding RNA HULC and investigate HULC expression in patientswith benign gastric tumors and normal controls,as to well as explore its clinical significance of early complementary diagnosis of gastric cancer(GC).Methods:Serum samples were collected at random from 100 primary cases,30 patients with gastric polyps and 110 age-matched normal controls were collected during the same period from the Physical Examination Center of the same hospital.Serum HULC expression levels were detected by RT-qPCR.Results:The RT-qPCR based assay was a reliablemethod to detect circulating HULC,which also had good linearity.The intra-and Inter-assay coefficients of variationswere 2.89%and 4.85%. The levels of serum HULC in GC patientswere 2.423±0.326,which was significantly higher than that of patients with gastric polyps(1.105±0.102)and normal controls(0.901±0.068)(P<0.01).there was="" no="" statistically="" significant="" difference="" between="" gastric="" polyps="" and="" normal="" controls(p="">0.05).The area under the ROC curve(AUC)of HULCwas up to 0.888（95%CI 0.843～0.934）,which was higher than that of CEA(0.694,95%CI 0.621～0.737)and CA72-4(0.514,95%CI 0.433～0.595).Conclusions:Themethod of RT-qPCR can detect circulating HULC rapidly and specificity.Serum HULC concentrationsmay be valuable in early complementary diagnosis of GC.
[Key words] gastric cancer;long non-coding RNAs;HULC [中圖分類號] R735.2 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A ［文章編號］1006-2440（2016）06-0561-05 [收稿日期] 2016-11-09 *[基金項(xiàng)目] 國家自然基金面上項(xiàng)目（81672099）；江蘇省重點(diǎn)研發(fā)專項(xiàng)（BE2015654）；南通市臨床實(shí)驗(yàn)診斷研究中心建設(shè)項(xiàng)目（HS2015002）。 **[作者簡介]董業(yè)峰，男，漢族，江蘇南通人，生于1974年4月，本科，主管技師。研究方向：臨床生物化學(xué)及分子生物學(xué)檢驗(yàn)。通信作者：鞠少卿，E-mail：jsq814@hotmail.com |
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