隨著2016年諾貝爾獎的揭曉，一時間風生水起，自噬再次成為熱中之熱！古詩有云：忽如一夜諾獎來，千人萬人做自噬！很多迷茫于課題的老師似乎看到了光明，找到了方向。然而，當我們討論自噬的時候，我們到底在說些啥？你，真的知道嗎？

今天，張博總結了目前自噬研究的三個前沿方向，希望能對各位老師的研究提供一點信息。廢話不說，步入正題?。P于自噬的原理請移步歷史消息《自噬，不可不知的諾獎級別熱點！》，沒錯！張大神早在兩個月以前就準確預測了這次諾獎！厲害了我的姐?。?/span>

自噬是由大約38個關鍵基因調控，通常統(tǒng)稱為ATG基因。對于各個基因的發(fā)現(xiàn)和功能研究一直是自噬研究的主體，這也是使大隅良典獲得諾貝爾獎的主要基石。另一方面，自噬過程復雜，包含多種蛋白，包括ULK1激酶和Vps34激酶。ATG與不同蛋白結合會發(fā)揮不同的功能。ATG互作蛋白及ATG翻譯后修飾對自噬的影響亦不容小覷。

ATG蛋白的功能，尤其是他們與一系列自噬調節(jié)因子的互作都是由磷酸化、糖基化、泛素化、乙?；⒅偷鞍姿獾确g后修飾（PTMs）來調控的。

(Xie, Y.C., et al., 2015. Posttranslational modification of autophagy–related proteins in macroautophagy.)

比如，在酵母里，自噬的發(fā)生需要在饑餓條件下抑制TORC1和PKA誘導的Atg1和Atg13d 磷酸化。而在哺乳動物細胞內，ULK1和BECN1被相應的激酶磷酸化之后有雙重作用。PRKAC和MAPK14作用下的LC3和ATG5磷酸化會分別導致自噬被抑制。而ULK1和ATG01介導的ATG13磷酸化則會促進相應的自噬通路。

其他修飾也會在自噬的調控產生的關鍵節(jié)點上有至關重要的作用。不同的翻譯后修飾可導致不同的自噬下游響應。PTMs在調節(jié)不同自噬階段的ATG蛋白功能方面很重要，依然有很多問題有待討論。比如PTMs怎么調控自噬的節(jié)奏？關鍵蛋白有哪些？對于結構的修飾有何影響？如何定量、定性？如何觀測？等等。細胞內的連鎖反應和上下游通路或許能夠解釋PTMs的作用，但是清楚的描述這些過程、機制、功能還需很大量的工作。解決這些問題不僅可以揭示自噬的基礎調節(jié)機制，更可以為自噬相關疾病的治療找到潛在靶點。尤其是將調節(jié)PTMs的上游機制剝離出來更是對制藥科學和靶向治療至關重要。

在腫瘤發(fā)生時，自噬可以通過降解細胞內物質來抵抗癌細胞在營養(yǎng)不足、缺氧壓力，或者化療藥物處理時產生的存活障礙；同時，由于自噬的放生，促凋亡因子被降解，從而實現(xiàn)促癌的作用。因此，抑制自噬在抑制腫瘤形成和癌細胞殺傷方面具有廣泛的、可預期的前景。一方面，自噬的抑制劑主要是抑制溶酶體的氯喹，目前還缺少對于其他抑制劑的探尋，另一方面當前抑制自噬的小分子藥物都并非特異，如何尋找到特異性的抑制劑也是熱門的藥物研發(fā)和轉化醫(yī)學方向之一。

如下表格總結了在自噬發(fā)生的各個不同階段，針對不同的通路和蛋白目前已知的抑制劑。

(Pasquier, B., 2016. Autophagy inhibitors.)

我們有理由相信，在眾多化合物中，通過化學優(yōu)化等方法我們或可以將其最終應用于臨床，而不單單是從科研層面利用抑制劑操縱自噬。抑制自噬是否可以真正為病人帶來福音尚無定論，但是以此為靶向治療癌癥卻是充滿潛力的。在氯喹類藥物的臨床實驗中，或許會給我們帶來一些啟發(fā)。然而，由于自噬是一個動態(tài)過程，清晰和準確的藥效解讀還不成熟。比如在K-ras突變導致的胰腺癌、非小細胞肺癌，以及mTOR通路影響的腎上皮細胞癌中，用藥有效患者人群和聯(lián)合用藥治療方案也是臨床上非常重要的點。

自噬的主要檢測方法有基于透射電子顯微鏡的超微結構形態(tài)學檢測、自噬體膜標志性蛋白質檢測和染色法間接自噬體檢測等。下圖總結了各種方法的優(yōu)缺點。由圖可見，我們現(xiàn)在檢測自噬主要是通過對LC3蛋白的觀察，可惜LC3蛋白是內源性且會被自噬降解，解讀結果往往存在不準確性。另外，目前還缺少自噬檢測的血清學標志物。

下圖對比了目前比較主流的幾種檢測自噬的方法，以便各位老師選擇適合自己的工具。

以上各種方法各有利弊。目前主流觀察自噬流變化的是LC3雙熒光標記法。本方法使用同時帶有RFP和GFP的慢病毒感染細胞。當自噬發(fā)生時，可見明亮黃光點，此為被紅光和綠光同時標記的自噬體；當自噬體和溶酶體融合，自噬溶酶體內的pH值降低，使得改造過的GFP蛋白熒光淬滅，只可觀測到紅光。

結尾彩蛋！胞自噬研究神器?。ù颂帒杏嘁衾@梁的掌聲！）

本節(jié)福利！特別獻給認真看文的老師！

這里我們要介紹一個研究自噬的神器，與大隅良典一樣來自日本的CQ1轉盤式激光共聚焦細胞成像流式細胞儀！日本Yokogawa是全世界激光共聚焦技術的領導者，與萊卡, Olympus, Nikon, PE等公司均有合作關系。CQ1儀器可精確計數(shù)并區(qū)分自噬發(fā)生與否。CQ1拍攝并且計數(shù)自噬體的數(shù)目可以給出更加直觀、量化的自噬發(fā)生過程。

CQ1轉盤式激光共聚焦細胞成像流式細胞儀

CQ1拍攝得到高分辨率自噬體并且自動計數(shù)

如上圖所示，CQ1儀器可以自動識別出自噬體并且計數(shù)分析，自噬點及細胞計數(shù)均較準確。我們可以發(fā)現(xiàn)實驗組在用雷帕霉素誘導之后，每個細胞內的自噬體明顯增多（約3倍），可明確區(qū)分自噬發(fā)生與否。這樣可視化的數(shù)據(jù)更加準確可靠，能夠動態(tài)的自噬分析提供另一個討論分析的角度，為文章大大加分！

CQ1的分析功能兼具整合和應用功能，它所提供的開放源代碼可以滿足各種不同的需求，另外CQ1的參數(shù)及其豐富，可以隨意搭配，邊掃描邊分析；同時其強大的售后團隊也為科研項目的順利進行提供了保證。

以上就是今天的張博小課堂，關于自噬的研究方向、自噬研究工具（KD/OE病毒、文庫、雙熒光慢病毒、誘導劑/抑制劑、儀器）的選擇，請戳下面張博小信箱，互相學習交流！祝大家的文章IF飆升~！

長按加關注