一、模板序列確定

模板的選擇。如果以DNA為模板設計引物，如果該基因組已經(jīng)完成測序，則可以直接通過BLAST找到相關基因位置，設計引物。如果沒有被測序，則首先在Genebank中找到與待分離新基因同源的其它物種的該基因。首先在NCBI找本屬的相同基因，屬名為拉丁文，注意查找。在genebank中以搜索FAD8為例，然后看檢索結(jié)果左邊頁面（如圖）找到所要查找的屬名后點擊結(jié)果就只顯示該屬的某物種的該基因的序列包括DNA，mRNA根據(jù)需要下載相應的序列利用http://www.ncbi.nlm./blast/的Blast工具和http://www./elustalw/的Clustalw工具把已檢索到的基因進行同源性比較，

注意：

1.找到同源基因的蛋白氨基酸序列，比對，找到高度同源區(qū)域，再回到cDNA序列設計引物,核苷酸序列同源性高，就用核苷酸，否則用氨基酸，設計簡并引物。一般在mRNA序列的中間偏下游即靠3'端的部分序列設計引物（習慣問題）。一般認為,如果蛋白的序列一致性為25-30%,則可認為序列同源。

2.簡并引物的設計

最好還是使用CDS序列來做比對，然后根據(jù)保守區(qū)設計簡并引物，CDS兩端的非翻譯區(qū)在物種間變化太大，不適合設計引物。把獲得各個物種的CDS做成fasta格式的，序列最好處理成純序列格式的不含其它任何字符。然后用比對軟件比對一下，如mega，DNAman或者是vectorNTI里的比對工具都可以做比對。在比對結(jié)果里找到非常保守的區(qū)域就可以設計簡并引物了。設計的簡并引物可以根據(jù)經(jīng)驗公式自個算Tm值。不用計較打分的問題。因為你只能在保守區(qū)設計引物。引物的3'端最好位于最保守的區(qū)域。一般是尋找該基因的ORF框即編碼區(qū)域作為該引物的保守序列。你可以用軟件查找ORF框，找一個比較長的位置在序列中下游的區(qū)域設計引物。

二、引物設計的原則

首先引物要跟模板緊密結(jié)合，其次引物與引物之間不能有穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構存在，再次引物不能在別的非目的位點引起DNA聚合反應（即錯配）。圍繞這幾條基本原則，設計引物需要考慮諸多因素，如引物長度（primerlength）、產(chǎn)物長度（product length）、序列Tm值(melting temperature)、ΔG值(internal stability)、引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構（duplexformation and hairpin）、錯誤引發(fā)位點（false priming site）、引物及產(chǎn)物GC含量（composition），有時還要對引物進行修飾，如增加限制酶切點，引進突變等。以使用Oligo 軟件分析設計引物為例，筆者總結(jié)出以下的要點：

1.引物的長度一般為15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因為過長會導致其延伸溫度大于74℃，即Taq 酶的最適溫度。

2.引物3’端的序列要比5’端重要。引物3’端的堿基一般不用A（3’端堿基序列最好是G、C、CG、GC），因為A在錯誤引發(fā)位點的引發(fā)效率相對比較高。另外引物間3’端的互補、二聚體或發(fā)夾結(jié)構也可能導致PCR反應失敗。5’端序列對PCR 影響不大，因此常用來引進修飾位點或標記物。

3.引物的GC含量一般為40-60%，以45-55％為宜，過高或過低都不利于引發(fā)反應。有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，導致引物的GC含量不能在上述范圍內(nèi)，這時應盡量使上下游引物的GC 含量以及Tm 值保持接近（上下游引物的GC含量不能相差太大，大概在2℃以下較好），以有利于退火溫度的選擇。如果G-C比例超出，則在引物的5’端增加As或Ts；而如果A-T比例過高，則同樣在5’端增加Gs或Cs

4.引物所對應模板序列的Tm 值最好在72℃左右。（Tm 值曲線以選取72 度附近為佳，5’到3’的下降形狀也有利于引物引發(fā)聚合反應），至少要在55－80℃之間

5.ΔG值(自由能)反映了引物與模板結(jié)合的強弱程度。一般情況下，引物的ΔG值最好呈正弦曲線形狀，即5’端和中間ΔG值較高，而3’端ΔG值相對較低，且不要超過9（ΔG值為負值，這里取絕對值），如此則有利于正確引發(fā)反應而可防止錯誤引發(fā)。3′末端雙鏈的ΔG是0～－2 kcal/mol時，PCR產(chǎn)量幾乎達到百分之百，隨著其絕對值的增加產(chǎn)量逐漸下降，在－6時只有40%、到－8時少于20%、而－10時接近于0。

6.可能的錯誤引發(fā)位點決定于引物序列組成與模板序列組成的相似性，相似性高則錯誤引發(fā)率高，錯誤引發(fā)的引發(fā)率一般不要高過100，如此可保證不出非目的產(chǎn)物的假帶。但對于特定的模板序列，還應結(jié)合比較其在正確位點的引發(fā)效率。如果兩者相差很大，比如在正確位點的引發(fā)效率為450 以上，而在錯誤位點的引發(fā)效率為130，并且不好找其他更合適的引物，那么這對引物也是可以接受的。

7.Frq 曲線為Oligo6新引進的一個指標，揭示了序列片斷存在的重復機率大小。選取引物時，宜選用Frq 值相對較低的片斷。

8.引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構的能量一般不要超過4.5，否則容易產(chǎn)生引物二聚體帶而且會降低引物濃度從而導致PCR 正常反應不能進行，與二聚體相關的一個參數(shù)是堿基的分布，3’端的連續(xù)GGG 或CCC 會導致錯誤引發(fā)。二聚體形成的能值越高越穩(wěn)定，越不符合要求。與二聚體相同，發(fā)夾結(jié)構的能值越低越好。雖然有些帶有發(fā)夾環(huán)，其ΔG為－3 kcal/mol的自身互補引物也可以得到不錯的結(jié)果，但是如果它的3′末端被發(fā)夾環(huán)占據(jù)時就很麻煩，即會引發(fā)引物內(nèi)部的延伸反應，減少了參與正式反應引物的數(shù)量。當然，如果發(fā)夾環(huán)在5′末端對反應就沒有多大的影響了。

9.以公式(4×G/C + 2×A/T–5)計算Tm值，即退火溫度。選擇較低Tm值的引物的退火溫度為反應的退火溫度。4-6℃的差別似乎對PCR產(chǎn)量影響不大。最好，保證每個引物的Tm值相匹配，且在70-75℃范圍內(nèi)

10.要知道，更重要的因素是模板與穩(wěn)定性較小的引物之間解鏈溫度的差異。差異越小，PCR的效率越高。因為DNA的解鏈溫度也取決于它的長度，所以有的研究者喜歡設計很長，而不求它很穩(wěn)定的引物。可是，引物太長就難以避免形成二聚體和自身互補，因此，一般還是不用為好。如果期待的產(chǎn)物長度等于或小于500bp，選用短的(16～18 mer)的引物：若產(chǎn)物長5 kb，則用24 mer的引物。有人用20～23 mer引物得到40 kb的產(chǎn)物。

11.在DNA測序和PCR中最好用5′末端穩(wěn)定(如GC含量較多)，而3′末端不太穩(wěn)定(如AT含量較多)的引物，這種引物的結(jié)構可以有效地消除假引發(fā)反應。這就是基于引物內(nèi)部穩(wěn)定性的經(jīng)驗之談。其3′末端穩(wěn)定性低的引物在這些反應中能起好作用的原因在于，接近或在3′末端上的堿基與非靶位點堿基所形成的配對的穩(wěn)定程度還不足以引發(fā)DNA合成，所以不會產(chǎn)生假產(chǎn)物。因此，為了有效地引發(fā)反應，引物的5′末端和中央部分必須與靶DNA也形成雙鏈。與此相反，帶有穩(wěn)定的、GC豐富的3′末端的寡核苷酸不需要其所有的核苷酸序列都與靶序列配對，只憑借其3′末端與靶序列任何位點的牢固配合就可以引發(fā)反應，產(chǎn)生非專一產(chǎn)物。無論如何，寡核苷酸3′末端最后5個核苷酸的穩(wěn)定性小于－9kcal/mol的，通常就是專一性的探針或引物。寡核苷酸3′末端越不穩(wěn)定，假引發(fā)的可能性越低。

12.如果用3′末端低穩(wěn)定性的引物，反應的最適退火溫度范圍會不尋常的寬。這就可以不經(jīng)過事先的最佳化實驗就能在最佳條件下進行反應。

13.引物的唯一性：為了放大單個的、專一性DNA片段，選用的引物序列就應當是唯一的，即在模板DNA中沒有重復序列。如果該物種有基因組，則檢查的方法非常簡單就是用引物序列去做blast，看看能比對到幾個位點，如果是唯一比對，則特異性會非常好。（做blast一般去NCBI Genome數(shù)據(jù)庫http://www.ncbi.nlm./genome/browse/，找到自己的物種，然后做blast即可）。應當避免使用同寡聚物(如—AAAAAA—)和二核苷酸重復(如—ATATAT—)。

14.引物和產(chǎn)物的Tm值不要相差太大，20攝氏度范圍內(nèi)較好。定下引物的Tm值范圍之后即可定下引物的長度范圍。

15.對引物的修飾一般是增加酶切位點，應參考載體的限制酶識別序列確定，常常對上下游引物修飾的序列選用不同限制酶的識別序列，以有利于以后的工作。

值得一提的是，各種模板的引物設計難度不一。有的模板本身條件較差，比如GC含量偏高或偏低，導致找不到各種指標都十分合適的引物；有時PCR產(chǎn)物要作為克隆對象插入到載體中表達，因此PCR引物設計的可選擇度很低。遇到這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件，這時，使用自動搜索引物及正確地評價引物可使研究人員對實驗心中有數(shù)。在設計克隆PCR引物時，引物兩端一般都添加酶切點，必然存在發(fā)夾結(jié)構，而且能值不會太低，這種PCR需要靈活調(diào)控退火溫度以達到最好效果，對引物的發(fā)夾結(jié)構的檢測就不應要求太高。如擴增出多條帶（引發(fā)錯配所致），不出目的帶或出目的帶很弱（引物引發(fā)效率低下）