1 EML4-ALK融合基因

EML4-ALK融合基因（gene fusion）是非小細胞肺癌（NSCLC）的重要驅動基因之一。EML4基因可在多個位點發(fā)生斷裂，與位于ALK第20外顯子的胞內(nèi)催化域相連，形成EML4-ALK融合基因。EML4斷裂位點不同可以與ALK形成至少10種以上的EML4-ALK融合基因變體（Variant），變體1和變體3最常見。ALK融合基因檢測目前存在FISH（檢測ALK擴增）、RT-PCR（檢測ALK變體類型）和Ventana IHC（檢測ALK蛋白表達）等三種主要檢測手段，三個方法高度一致^[1]。

2 ALK二次突變

       ALK蛋白激酶結構域的二次突變是克唑替尼的主要耐藥機制，最常見的8種二次突變見圖1。L1196M是守門員突變，機制類似EGFR的T790M突變，而G1202R對多數(shù)ALK抑制劑不敏感。其它耐藥機制為EGFR激活、ALK擴增、SRC激活和cKit擴增等^[2]。

EML4-ALK 基因全長達到4860個堿基，編碼1620個氨基酸，可能發(fā)生的二次遠不止圖1中8種，臨床研究中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了其它二次突變，比如：F1174C、D1203N、I1171T等。一個ALK陽性NSCLC患者體內(nèi)還可能有一種以上ALK突變^[2]。

3 ALK二次突變的演化規(guī)律

3.1色瑞替尼（Ceritinib）

Gainor等對一項色瑞替尼臨床試驗（NCT01283516）中的23名ALK陽性患者進行克唑替尼治療后/色瑞替尼治療前的再活檢，用FISH方法在19例患者中發(fā)現(xiàn)了原發(fā)的ALK融合持續(xù)存在，在2例患者中發(fā)現(xiàn)了ALK擴增。用直接測序法在7例患者中發(fā)現(xiàn)了克唑替尼耐藥突變（C1156Y，L1196M，S1206Y，G1269M，1151T），色瑞替尼對7名患者均有效，其中1151T突變的患者PFS為2.7月，可能與色瑞替尼對1151T的IC₅₀較高有關^[3]。

克唑替尼和色瑞替尼對存在ALK二次突變和不存在ALK二次突變的二類患者的無進展生存期并未發(fā)現(xiàn)顯著統(tǒng)計學差異。

Gainor等另外對11名色瑞替尼耐藥患者進行了基因檢測，結果見表1。

3.2艾樂替尼（Alectinib）

艾樂替尼的耐藥突變?yōu)镚1202R、I1171N/S、R1209Q、V1180L等[5,6]。

Oscar Puig等用二代測序法（NGS）對艾樂替尼的二個臨床試驗NP28673和NP28761里的ALK陽性NSCLC患者進行了組織和外周血的基因檢測，見表2。

在12名克唑替尼患者身上發(fā)現(xiàn)了13種ALK耐藥突變（F1174C，L1196M，S1157F，R1231W，G1128A，V476A，I1171T，G1269A，C1156F，S1206Y，F1245C，A416P），其中5種突變?yōu)橐郧拔墨I未見。攜帶F1174C，L1196M，S1157F，R1231W，G1128A，G1269A，C1156F突變的患者經(jīng)艾樂替尼治療PFS超過3個月以上，攜帶S1206Y和F1245C雙突變的患者對艾樂替尼無效，攜帶S1157F突變的患者穩(wěn)定15.4個月。

對4名艾樂替尼耐藥后ALK突變情況進行了檢測，結果見表3。

另外，Oscar Puig對45名仍在服用艾樂替尼的患者進行了外周血中ALK等位基因豐度的變化趨勢，對艾樂替尼敏感的幾種Alk突（F1174V/L，S1157F，T1151R，S1206F，I1268V，G1269A，C1156C/F等）呈下降趨勢，而對艾樂替尼耐藥的幾種Alk突變（G1202R、I1171N/S、R1209Q、V1180L）呈上升趨勢，見圖2。

在2名患者中還發(fā)現(xiàn)了多種ALK突變共存現(xiàn)象，一名攜帶T1151M的患者，服用艾樂替尼期間出現(xiàn)了G1202R和I1171N/S三種突變，而T1151M突變消失了。另一名攜帶I1171T和F1174V的患者，服用艾樂替尼期間新增了R1209Q突變，而I1171T和F1174V的等位基因豐度不斷降低中^[6]。

3.3 Brigatinib（AP26113）

Scott N.gettinger等使用二代測序法（NGS）對Brigatinib的36名臨床試驗患者的腫瘤組織進行了基因檢測，其中32名檢測了入組前的組織，4名檢測了Brigatinib耐藥后的腫瘤組織。有效數(shù)據(jù)見表4，攜帶ALK突變的患者的ORR高于不攜帶ALK突變的患者^[7]。           

3.4 Ensartinib（X-396）

2016年ASCO會議報道了Ensartinib II期臨床部分數(shù)據(jù)，劑量≥200mg每天一次的ALK陽性非小細胞肺癌患者38人，其中克唑替尼未治的8人，克唑替尼耐藥的20人，克唑替尼和色瑞替尼耐藥的7人，克唑替尼、色瑞替尼和艾樂替尼耐藥的2人，克唑替尼、色瑞替尼和Brigatinib耐藥的1人。使用二代測序NGS檢測患者中組織和血液的ALK突變基因

克唑替尼耐藥的患者可評價的人數(shù)為13人，85%的患者仍為ALK陽性，3人攜帶ALK二次突變，一名T1151M的患者PFS為4個月，一名L1196M的患者PFS為5個月，該2名患者Ensartinib耐藥后基因數(shù)據(jù)缺失；一名攜帶G1269A的患者PFS為13個月，Ensartinib耐藥后攜帶L1196M+G1269A突變；無效的一名患者為QSLP1188P+R1133Q+S1206F突變，肺部有效，腦部進展?？诉蛱婺岷蜕鹛婺崮退幍幕颊呖傆行蕿?/span>29%，一名PFS大于9個月，另一名有G1202R+HER2突變，PFS5個月，進展后發(fā)現(xiàn)G1202R+V1149M突變，G1202R豐度從0.7%增加到1.7%；進展患者中有一名患者肺部完全緩解，腦部進展，另一名患者為G1202R突變（豐度0.5%）。

3.5 Lorlatinib （PF-06463922）

Lorlatinib剛開始2期臨床，其耐藥信息不足，目前僅報道一例C1156Y+L1198F雙突變的耐藥患者，重回克唑替尼有效^[9]。

4 總結和討論

ALK融合基因陽性和二次突變情況見表6。

4.1 ALK陽性患者在克唑替尼耐藥后，及經(jīng)艾樂替尼、色瑞替尼、Brigatinib或Ensartinib序貫治療后，絕大多數(shù)患者仍為ALK陽性。

4.2在多種ALK抑制劑序貫治療后，ALK二次突變在耐藥患者中所占比例大大增加，而種類大大減少。

4.3 克唑替尼耐藥患者經(jīng)2代或3代ALK抑制劑治療后，出現(xiàn)了雙突變，甚至三突變。比如Brigatinib對E1210K、D1203N、G1269A等單獨突變均有效，復合突變后無效。對于這類多重耐藥突變的機理仍需要進一步研究。

4.4雖然Brigatinib、Ensartinib 和Lorlatinib 在臨床試驗里顯示了對G1202R的有效性，但G1202R突變在除Lorlatinib外的ALK抑制劑耐藥患者中均有存在。

4.5 外周血中的ALK等位基因豐度變化趨勢可以輔助評估治療效果。

4.6 ALK抑制劑的序貫或切換使用，目前僅有極少數(shù)成功實例，還需要更多的臨床證據(jù)。

目前亟需準確可靠的二代測序服務，為ALK陽性患者用藥起指導作用。