第一臺測序儀的誕生

454 生命科學（454 Life Sciences）可謂新一代測序技術(shù)的奠基人。它的創(chuàng)始人是生物界的傳奇人士：Jonathan Rothberg。正如蘋果砸牛頓一樣，任何發(fā)明創(chuàng)造的背后都有個故事。Rothberg 的版本是這樣的。當年，他的兒子一出生，就被送進嬰兒特別護理病房接受治療，那時 Rothberg 整天都在擔心自己的孩子會不會天生有什么問題。于是，他下定決心要開發(fā)一種快速便宜的測序技術(shù)。

2005 年，Rothberg 的夢想終于實現(xiàn)了。454 生命科學等研究人員于 7 月在《 Nature 》雜志上發(fā)表了一篇題為“Genome sequencing in microfabricated high-density picoliter reactors ”的文章，介紹了一種邊合成邊測序（sequencingby synthesis）的技術(shù)，比傳統(tǒng)的 Sanger 測序快 100 倍。

這種技術(shù)合成 DNA 片段，并將它們分開平行測序，再重新組合成基因組。它的效果也通過生殖支原體（Mycoplasma genitalium）這種細菌的測序而得到了證明。在 4 小時內(nèi)，研究人員就完成了測序，且準確性超過 99.99% 。454 的方法之所以引起轟動，不僅是因為這個成果，而是因為它繞過了 Sanger 測序的限制，未來有望使測序時間和成本進一步下降。

人類基因組計劃的首席科學家 Francis S. Collins 博士對此評價道：“測序技術(shù)需要變得更小、更快速、更便宜，才能滿足個性化醫(yī)療的承諾。我們期待這種創(chuàng)新技術(shù)能夠應用在生物醫(yī)學研究，并最終應用于臨床?！钡拇_，隨著通量提高 100 倍，這種技術(shù)開辟了測序的新用途，包括個性化醫(yī)療、傳染病防治等。

不久之后，454 生命科學與羅氏合作，正式推出了 Genome Sequencer 20（GS20）系統(tǒng)。這是第一臺商業(yè)化的新一代測序儀，為高通量的 DNA 測序提供了一個方便的方案。它在 PicoTiterPlate 上開展大規(guī)模并行測序，采用先進的圖像處理，并利用獨特的數(shù)據(jù)分析，以獲得高質(zhì)量的結(jié)果。樣品制備之后，GS20 能夠在 5 小時的運行內(nèi)至少測序 2000 萬個堿基（20 Mb）。

這臺儀器甫一上市，就引起了科學界的關(guān)注。盡管價格不菲（50 萬美元），但 2005 年總共在全球安裝了 20 臺，包括 Broad 研究院、Sanger 研究院和 JGI，研究成果也陸續(xù)發(fā)表。此外，GS20 也榮獲了多個獎項，包括 R&D 100 大獎和華爾街日報的 2005 技術(shù)創(chuàng)新獎。

在收獲掌聲的同時，454 生命科學也在對 GS20 系統(tǒng)進行硬件和軟件的升級，希望將讀長從 100 bp 提高到 200 bp，甚至 400 bp，也力爭大幅提高通量。這些后來都實現(xiàn)了。最初的一年，454 并沒有碰到強勁的對手，但隨著 Solexa 儀器的問世，這一局面很快被打破。

Solexa 閃亮登場

早些年，人們在談到新一代測序儀時，經(jīng)常會提起 Solexa，而不是 Illumina。這是一家低調(diào)的公司，規(guī)模也不大，但是測序技術(shù)卻非常新穎。它開發(fā)出的測序儀，在通量上領(lǐng)先于其他競爭產(chǎn)品。收購 Solexa，也成為 Illumina 的轉(zhuǎn)折點，從此踏上高速發(fā)展的道路。

Solexa 成立于 1998 年的夏天，創(chuàng)始人是劍橋大學的化學家。它的核心是可逆測序技術(shù)，也就是在大規(guī)模并行的芯片上，通過直徑為 1 微米的孔，每次測序一個堿基并成像。他們的目標是每次運行能獲得 10 億個堿基（1Gb）。這在當時簡直就像天方夜譚。風投告訴他們，如果能實現(xiàn) 1 Gb 的十分之一，就已經(jīng)很不錯了。

之后經(jīng)過一系列改進，并從瑞士測序公司 Manteia 處收購了簇生成技術(shù)，也就是將 DNA 鏈擴增成含有 1000 個相同分子的簇，Solexa 的測序儀漸入佳境，讀長也從最初的 12bp 穩(wěn)步提高到 25bp。最后，研發(fā)人員開始建立 IT 系統(tǒng)，來管理和評估數(shù)據(jù)的質(zhì)量。至此，Solexa 的測序儀已初具雛形。

2005 年初，Solexa 決定測序第一個真正的基因組，著名的 ΦX174 噬菌體基因組。2 月的一個周末，生物信息學家 Clive Brown 發(fā)郵件給同事，標題上寫著：“我們做到了！”噬菌體基因組被重新測序，且準確性超過 99.9%。有趣的是，他們并沒有發(fā)表文章。他們感興趣的是專利。

過了一年，Solexa 正式推出 1G Genetic Analyzer，宣稱能夠在 3 個月內(nèi)以 10 萬美元完成人類基因組測序。對于 10 萬美元的數(shù)字，CEO John West是這樣解釋的：“人類基因組有 30 億個堿基，重測序的覆蓋度大約是 15 倍。因此需要 45 億個堿基。如果每個運行要兩天，那就是 90 天。流動槽的定價將從 3000 美元降至 1000 美元，因此 45 個流動槽是 45000 元。如果考慮到儀器價格（40 萬美元）和五年折舊，那么三個月就是 20000 元?！?/span>

不過，West 的承諾在 2006 年并沒有實現(xiàn)。對于 30bp 的讀長而言，人類基因組的組裝是一項巨大的信息學挑戰(zhàn)。當時，Sanger 研究院每周已經(jīng)產(chǎn)生了 10-15 Gb 的數(shù)據(jù)。Clive Brown 開發(fā)出一款名為 the pipeline 的軟件給客戶使用，之后，它演化成為大家熟悉的 CASAVA。

2006 年 11 月，Illumina CEO Jay Flatley 向 Solexa 發(fā)出了 6.5 億美元的收購要約，以補充 Illumina 當時的基因分型和基因表達平臺。此次收購被劍橋大學新聞辦公室認為是“劍橋大學最成功的商業(yè)化故事之一”。Flatley 表示：“這次收購可能會被證明是最成功的收購之一，以及生命科學史上的新技術(shù)引進?！?/span>

Flatley 的預言并沒有錯。到 2007 年 2 月，Illumina 已經(jīng)售出了 12 臺儀器，之后又接到了幾十個新訂單。盡管它的讀長遠不及 454，但通量和每 Gb 的成本相當有利。到年底，GA 儀器的安裝數(shù)量已超過 200 臺，并在 2008 年再次翻番。2008 年春天，Illumina 推出了 GAII，硬件和軟件都經(jīng)過升級，讀長提高到 50bp，通量達到每次運行 3 Gb。彼時，他們終于達到了 10 萬美元人類基因組測序的里程碑。

之后的故事大家也許都聽過了。2008 年 5 月，荷蘭科學家利用 GA 首次繪制出女性的個人基因組圖譜。11 月，《 Nature 》雜志發(fā)表了三個人類基因組圖譜：炎黃一號–第一個亞洲人圖譜；第一個癌癥病人圖譜；第一個非洲人圖譜。這都有 GA 的功勞。

當時，Illumina 并非沒有競爭對手。除了 454，Sanger 測序的領(lǐng)導者 ABI 也在開發(fā)新一代測序平臺。Illumina 搶先進入市場，拔得頭籌。正如 Illumina 科學家 John Milton 所言，這是 GA 領(lǐng)先 SOLiD 系統(tǒng)的主要原因?！耙坏┻M入基因組中心，每個人都經(jīng)過培訓，那么他們就會堅持使用[這種技術(shù)]?！边@也是 Sanger 研究院堅持使用 Illumina 平臺的主要原因。

當然，ABI 并非等閑之輩，他們也在奮力追趕。

ABI 奮起直追

說起全自動測序儀，Applied Biosystems （ABI） 那是絕對的領(lǐng)頭羊，其 3730 旗艦測序儀在人類基因組計劃中立下赫赫戰(zhàn)功。然而，在新一代測序方面，454 和 Solexa 搶了先機，率先推出了 NGS 儀器。ABI 當然不會作壁上觀，讓客戶的實驗室里擺滿對手的儀器。

于是，它在 2006 年斥資 1.2 億美元收購了遺傳分析公司 Agencourt Personal Genomics （APG），為的是第二年將新一代測序系統(tǒng)推向市場。APG 的核心技術(shù)是 SOLiD （supported oligoligation detetion），其獨特之處在于以四色熒光標記寡核苷酸的連續(xù)連接合成為基礎(chǔ)，取代了傳統(tǒng)的聚合酶連接反應，可對單拷貝 DNA 片段進行大規(guī)模擴增和高通量并行測序。

SOLiD 系統(tǒng)原本計劃在 2008 年推出，但 ABI 擴大了研發(fā)團隊，努力提高通量和讀長。同時，早期試用客戶也對這個系統(tǒng)給出了積極的反饋。因此，ABI 在 2007 年美國人類遺傳學協(xié)會的年會上正式推出了 SOLiD 系統(tǒng)。儀器標價為 60 萬美元，包括輔助設(shè)備和計算機，高于 454 和 Solexa 的儀器。

就當時而言，SOLiD 系統(tǒng)是通量最高的新一代測序平臺，每次運行可以產(chǎn)生 4Gb 的數(shù)據(jù)。此外，由于它采用雙堿基編碼技術(shù)，在測序過程中對每個堿基判讀兩遍，能夠區(qū)分測序錯誤和多態(tài)性，故原始數(shù)據(jù)的準確性接近 99.95%，高于其他的新一代測序平臺。這也成為它的主要賣點之一。

2008 年，在 Illumina 宣布將人類基因組測序費用降至 10 萬美元后不久，ABI 就宣布，利用 SOLiD 測序平臺，人類基因組的測序成本低于 6 萬美元。這個價格包括樣品制備以及測序試劑的費用，但不包括人工和儀器折舊成本。而在一年前，454 生命科學對諾貝爾獎得主 James Watson 的基因組進行測序，費用接近 100 萬美元。

在 ABI 科學運營高級主管 Kenvin McKeman 的指導下，科學家們采用 ABI 的 SOLiD 系統(tǒng)對國際 HapMap 計劃中包含的一個人類 DNA 樣本進行重新測序。SOLiD 系統(tǒng)總共運行 7 次，產(chǎn)生 36Gb 的序列數(shù)據(jù)，相當于 12 倍的覆蓋度。單次運行最高可產(chǎn)生高達 9Gb 的數(shù)據(jù)，領(lǐng)先于其他測序平臺。

McKernan 表示：“我們相信這項研究驗證了新一代測序技術(shù)的前景，這些技術(shù)降低了分析人類基因組信息的成本，提高了精確度和速度。每個技術(shù)里程碑都使我們向著個性化醫(yī)療的方向邁進?！?/span>

至此，454、Illumina 和 ABI 在新一代測序領(lǐng)域形成了三足鼎立的局面。正是這種你追我趕，讓人類基因組圖譜的繪制成本大大降低，時間也大大縮短。不過，Illumina 率先進入大型的基因組中心，搶占了先機。此后它又推出了高通量的 HiSeq 系列，在通量上領(lǐng)先于 SOLiD。因此，ABI （及后來的 Life Technologies） 始終無力追趕。根據(jù) Frost & Sullivan 對 2010 年 NGS 市場份額的統(tǒng)計，Illumina 占 69%，Life Tech 占 16%，Roche 占 15%。

好在，Life Tech 高瞻遠矚，放眼快速經(jīng)濟的測序市場，在 2010 年收購了 Ion Torrent 公司。盡管這種半導體測序儀未必適合 30 億個堿基的人類基因組測序，但卻是更多小型實驗室的理想選擇。

后起之秀 PacBio

在新一代測序技術(shù)崛起的早期，市場主要被 Illumina、Life Tech 和 Roche 這三家公司占領(lǐng)。偶爾也有一些新的測序平臺出現(xiàn)，但大多是雷聲大雨點小，不久便沒了下文。面對這些強大、成熟的系統(tǒng)，新平臺要想站穩(wěn)腳跟，的確不是件容易的事。

在 2010 年的 AGBT 年會上，Pacific Biosciences 的測序儀吸引了眾人的注意。這臺名為 PacBio RS的測序儀被稱為第三代測序平臺，而有別于之前推出的二代測序平臺。至于什么是第三代測序，PacBio 當時的 CEO Hugh Martin 是這樣解釋的，“它就是在第二代測序（通量、成本）的基礎(chǔ)上添加非常長的讀長、極低的試劑成本，以及快速的運行時間”。

的確，PacBio RS 系統(tǒng)有著其他系統(tǒng)無可比擬的讀長，超過 1000 個堿基。這是因為 PacBio 的單分子實時 （SMRT） 測序反應是最接近天然狀態(tài)的聚合酶反應體系，最大限度地保持了聚合酶的活性。此外，樣品制備非?？焖?，只需要 4-6 小時，而不是幾天。制備過程不需要 PCR，從而減少了錯誤和偏向。從樣本制備到測序，所需的時間還不到一天。

對于重測序而言，短讀長也許不是大問題，但是對于 denovo 測序，這可讓人們吃盡苦頭。例如，韓國極地研究所的 Hyun Park 在測序一種 GC 含量高達 71% 的極地微生物時發(fā)現(xiàn)，即使利用 Illumina 平臺進行 200X 深度測序，仍無法獲得完整的基因組圖。組裝時產(chǎn)生了 185 個 Contig，而且缺口數(shù)量太多，根本無法通過 Sanger 法有效補齊。他們只好求助于 PacBio，而后僅用 15X 覆蓋度就能組裝得到 26 個 Contig，最終獲得了完整的基因組信息。

隨后，《 Nature Methods 》上發(fā)表的一篇文章又再次讓 PacBio 成為關(guān)注的焦點。研究人員利用 SMRT 技術(shù)，直接測定了 DNA 的甲基化，這是二代測序技術(shù)無法實現(xiàn)的，因為它們在測序前需要 PCR 擴增，一擴增這些修飾標記就被置換而消失殆盡了。SMRT 技術(shù)利用 DNA 聚合酶的動力學特征，對堿基摻入時產(chǎn)生的停頓間隔脈沖信號足夠敏感，可區(qū)分 12 種以上不同類型的堿基修飾。這些信息也幫助解析了歐洲大腸桿菌疫情的元兇 E.coli O104:H4。

然而，PacBio 也受到高錯誤率的困擾。人們一聽到 85-87% 的原始準確性就嚇壞了。雖然 PacBio 也澄清，這是由于在測序過程中單個分子信號弱，偶爾會出現(xiàn)信號難于分辨的情況。出錯幾率是隨機的，與序列長度、序列組成無關(guān)。只要提高循環(huán)次數(shù)，就能夠提高準確率。不過，PacBio 的業(yè)務(wù)還是一度陷入低迷，股價在 1 塊多徘徊。

2012 年，事情開始出現(xiàn)轉(zhuǎn)機。冷泉港實驗室的 Michael Schatz 開發(fā)了一種糾錯算法，用二代測序的短讀長高精確數(shù)據(jù)對三代長讀長數(shù)據(jù)進行糾錯，這種稱為“混合糾錯拼接”的算法發(fā)表在 7 月的《 Nature Biotechnology 》上。通過混合糾錯法，他們發(fā)現(xiàn)“數(shù)據(jù)幾近完美”。

這種方法融合了二代測序和三代測序的優(yōu)勢。“對于短讀長，哪怕無限制地提高覆蓋度，也不能解決復雜區(qū)域的測序問題。但長讀長可以跨越這次復雜區(qū)域，因此不需要太高的覆蓋度就可以對付。同理，長讀長也可以用于檢測并鑒定單倍體型和轉(zhuǎn)錄本的可變剪切，”Schatz 談道。

第二年，PacBio 發(fā)布了新版本的測序儀 – PacBio RS II，平均讀長達 5,000 bp，最長讀長超過 20,000bp，且通量較之前的版本增加一倍。隨著硬件和軟件的不斷升級，訂單數(shù)量也開始增加。到 2013 年底，PacBio 更與 Roche 合作，聯(lián)手打造一款臨床測序產(chǎn)品。此后，引用 PacBio 系統(tǒng)的研究成果不斷在各種刊物上發(fā)表。

Illumina 超高通量測序平臺 HiSeq X Ten 的上市也為 PacBio 帶來了新訂單。韓國公司 Macrogen 和 J. Craig Venter 的 Human Longevity 在安裝了 HiSeq X Ten 系統(tǒng)之后都購買了兩臺 PacBio RS II 系統(tǒng)。他們在開展大規(guī)模人類基因組測序研究時，希望利用 PacBio 的長讀長來弄清結(jié)構(gòu)變異及其他復雜區(qū)域。

至此，PacBio 完成了一次漂亮的逆襲。它憑借自身的獨特優(yōu)勢，在競爭激烈的新一代測序市場上站穩(wěn)腳跟，并帶來豐碩的研究成果。當然，儀器仍在不斷升級。最新型號的 Sequel 測序儀將在明年上市。

轉(zhuǎn)自《生物探索》