質(zhì)譜原理簡介:
質(zhì)譜分析是先將物質(zhì)離子化,按離子的質(zhì)荷比分離,然后測量各種離子譜峰的強(qiáng)度而實現(xiàn)分析目的的一種分析方法.以檢測器檢測到的離子信號強(qiáng)度為縱坐標(biāo),離子質(zhì)荷比為橫坐標(biāo)所作的條狀圖，就是我們常見的質(zhì)譜圖.
常見術(shù)語:
質(zhì)荷比:
離子質(zhì)量(以相對原子量單位計)與它所帶電荷(以電子電量為單位計)的比值,寫作m/Z.
峰: 質(zhì)譜圖中的離子信號通常稱為離子峰或簡稱峰.
離子豐度: 檢測器檢測到的離子信號強(qiáng)度.
基峰: 在質(zhì)譜圖中,指定質(zhì)荷比范圍內(nèi)強(qiáng)度最大的離子峰稱作基峰.
總離子流圖;質(zhì)量色譜圖;準(zhǔn)分子離子;碎片離子;多電荷離子;同位素離子
總離子流圖:在選定的質(zhì)量范圍內(nèi),所有離子強(qiáng)度的總和對時間或掃描次數(shù)所作的圖,也稱TIC圖.
質(zhì)量色譜圖：指定某一質(zhì)量(或質(zhì)荷比)的離子其強(qiáng)度對時間所作的圖.
利用質(zhì)量色譜圖來確定特征離子,在復(fù)雜混合物分析及痕量分析時，是LC/MS測定中最有用的方式.當(dāng)樣品濃度很低時，LC/MS的TIC上往往看不到峰,此時,根據(jù)得到的分子量信息,輸入M+1或M+23等數(shù)值,觀察提取離子的質(zhì)量色譜圖,檢驗直接進(jìn)樣得到的信息是否在LC/MS上都能反映出來,確定LC條件是否合適,以后進(jìn)行MRM等其他掃描方式的測定時可作為參考.
質(zhì)量色譜圖
總離子流圖
準(zhǔn)分子離子:指與分子存在簡單關(guān)系的離子,通過它可以確定分子量.液質(zhì)中最常見的準(zhǔn)分子離子峰是[M+H]+ 或[M-H]- .
在ESI中,
往往生成質(zhì)量大于分子量的離子如M+1,M+23,M+39,M+18......稱準(zhǔn)分子離子,表示為:[M+H]+,[M+Na]+等
碎片離子:準(zhǔn)分子離子經(jīng)過一級或多級裂解生成的產(chǎn)物離子.
碎片峰的數(shù)目及其豐度則與分子結(jié)構(gòu)有關(guān),數(shù)目多表示該分子較容易斷裂,豐度高的碎片峰表示該離子較穩(wěn)定,也表示分子比較容易斷裂生成該離子.
Ephedrine, MW = 165
多電荷離子:指帶有2個或更多電荷的離子,常見于蛋白質(zhì)或多肽等離子.有機(jī)質(zhì)譜中,單電荷離子是絕大多數(shù),只有那些不容易碎裂的基團(tuán)或分子結(jié)構(gòu)-如共軛體系結(jié)構(gòu)-才會形成多電荷離子.它的存在說明樣品是較穩(wěn)定的.采用電噴霧的離子化技術(shù),可產(chǎn)生帶很多電荷的離子,最后經(jīng)計算機(jī)自動換算成單質(zhì)/荷比離子.
同位素離子：由元素的重同位素構(gòu)成的離子稱為同位素離子.
各種元素的同位素,基本上按照其在自然界的豐度比出現(xiàn)在質(zhì)譜中,這對于利用質(zhì)譜確定化合物及碎片的元素組成有很大方便,
還可利用穩(wěn)定同位素合成標(biāo)記化合物,如:氘等標(biāo)記化合物,再用質(zhì)譜法檢出這些化合物,在質(zhì)譜圖外貌上無變化,只是質(zhì)量數(shù)的位移,從而說明化合物結(jié)構(gòu),反應(yīng)歷程等
如何看質(zhì)譜圖:
(1)確定分子離子,即確定分子量
氮規(guī)則:含偶數(shù)個氮原子的分子,其質(zhì)量數(shù)是偶數(shù),含奇數(shù)個氮原子的分子,其質(zhì)量數(shù)是奇數(shù).與高質(zhì)量碎片離子有合理的質(zhì)量差,凡質(zhì)量差在3~8和10~13,21~25之間均不可能,則說明是碎片或雜質(zhì).
(2)確定元素組成,即確定分子式或碎片化學(xué)式
高分辨質(zhì)譜可以由分子量直接計算出化合物的元素組成從而推出分子式
低分辨質(zhì)譜利用元素的同位素豐度,例:
(3)峰強(qiáng)度與結(jié)構(gòu)的關(guān)系
豐度大反映離子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定
在元素周期表中自上而下,從右至左,雜原子外層未成鍵電子越易被電離,容納正電荷能力越強(qiáng),含支鏈的地方易斷,這同有機(jī)化學(xué)基本一致,總是在分子最薄弱的地方斷裂.
不同類型有機(jī)物有不同的裂解方式
相同類型有機(jī)物有相同的裂解方式,只是質(zhì)量數(shù)的差異
需要經(jīng)驗記憶.
質(zhì)譜解析的一般步驟
(適于低分辨小分子譜圖,若已經(jīng)是高分辨質(zhì)譜圖得到元素組成更好)
(1)核對獲得的譜圖,扣除本底等因素引起的失真,考慮操作條件是否適當(dāng)
(2)綜合樣品其他知識:例如熔點(diǎn),沸點(diǎn),溶解性等理化性質(zhì),樣品來源,光譜,波譜數(shù)據(jù)等.
(3) 盡可能判斷出分子離子.
(4)
假設(shè)和排列可能的結(jié)構(gòu)歸屬:高質(zhì)量離子所顯示的,在裂解中失去的中性碎片,如M-1,M-15,M-18,M-20,M-31......意味著失H,CH3,H2O,HF,OCH3......
(5)假設(shè)一個分子結(jié)構(gòu),與已知參考譜圖對照,或取類似的化合物,并作出它的質(zhì)譜進(jìn)行對比.
有機(jī)質(zhì)譜的特點(diǎn)
優(yōu)點(diǎn):
(1)定分子量準(zhǔn)確,其它技術(shù)無法比.
(2)靈敏度高,常規(guī)10-7—10-8g,單離子檢測可達(dá)10-12g.
(3)快速,幾分甚至幾秒.
(4)便于混合物分析,LC/MS,MS/MS對于難分離的混合物特別有效, 其它技術(shù)無法勝任.
(5)多功能,廣泛適用于各類化合物.
局限性:
(1)異構(gòu)體,立體化學(xué)方面區(qū)分能力差.
(2)重復(fù)性稍差,要嚴(yán)格控制操作條件.所以不能象低場NMR,IR等自己動手,須專人操作.
(3)有離子源產(chǎn)生的記憶效應(yīng),污染等問題.
(4)價格稍顯昂貴,操作有點(diǎn)復(fù)雜.
質(zhì)譜儀器:
質(zhì)譜儀由以下幾部分組成
數(shù)據(jù)及供電系統(tǒng)
┏━━━━┳━━━━━╋━━━━━━┓
進(jìn)樣系統(tǒng) 離子源 質(zhì)量分析器 檢測接收器
┗━━━━╋━━━━━┛
真空系統(tǒng)
真空系統(tǒng)
質(zhì)譜儀的離子源,質(zhì)量分析器和檢測器必須在高真空狀態(tài)下工作,以減少本底的干擾,避免發(fā)生不必要的離子-分子反應(yīng).所以質(zhì)譜反應(yīng)屬于單分子分解反應(yīng).利用這個特點(diǎn),我們用液質(zhì)聯(lián)用的軟電離方式可以得到化合物的準(zhǔn)分子離子,從而得到分子量.
由機(jī)械真空泵(前極低真空泵),擴(kuò)散泵或分子泵(高真空泵)組成真空機(jī)組,抽取離子源和分析器部分的真空.
只有在足夠高的真空下,離子才能從離子源到達(dá)接收器,真空度不夠則靈敏度低.
進(jìn)樣系統(tǒng)
把分析樣品導(dǎo)入離子源的裝置,包括:直接進(jìn)樣,GC,LC及接口,加熱進(jìn)樣,參考物進(jìn)樣等.
離子源
使被分析樣品的原子或分子離化為帶電粒子(離子)的裝置,并對離子進(jìn)行加速使其進(jìn)入分析器,根據(jù)離子化方式的不同,有機(jī)質(zhì)譜中常用的有如下幾種,其中EI,ESI最常用.
EI(Electron Impact Ionization):電子轟擊電離—硬電離.
CI(Chemical Ionization):化學(xué)電離—核心是質(zhì)子轉(zhuǎn)移.
FD(Field Desorption):場解吸—目前基本被FAB取代.
FAB(Fast Atom Bombardment):快原子轟擊—或者銫離子 (LSIMS,液體二次離子質(zhì)譜 ) .
ESI(Electrospray
Ionization):電噴霧電離—屬最軟的電離方式.適宜極性分子的分析,能分析小分子及大分子(如蛋白質(zhì)分子多肽等)
APCI(Atmospheric Pressure Chemical
Ionization):大氣壓化學(xué)電離—同上,更適宜做弱極性小分子.
APPI(Atmospheric Pressure PhotoSpray
Ionization):大氣壓光噴霧電離—同上,更適宜做非極性分子.
MALDI(Matrix Assisted Laser
Desorption):基體輔助激光解吸電離.通常用于飛行時間質(zhì)譜和FT-MS,特別適合蛋白質(zhì),多肽等大分子.
其中ESI,APCI,APPI統(tǒng)稱大氣壓電離(API)
實驗室現(xiàn)有的離子源:
ESI電噴霧電離源 APCI大氣壓化學(xué)電離源
電噴霧(ESI)的特點(diǎn)
通常小分子得到[M+H]+ ]+,[M+Na]+
或[M-H]-單電荷離子,生物大分子產(chǎn)生多電荷離子,由于質(zhì)譜儀測定質(zhì)/荷比,因此質(zhì)量范圍只有幾千質(zhì)量數(shù)的質(zhì)譜儀可測定質(zhì)量數(shù)十幾萬的生物大分子.
電噴霧電離是最軟的電離技術(shù),通常只產(chǎn)生分子離子峰,因此可直接測定混合物,并可測定熱不穩(wěn)定的極性化合物;其易形成多電荷離子的特性可分析蛋白質(zhì)和DNA等生物大分子;通過調(diào)節(jié)離子源電壓控制離子的碎裂(源內(nèi)CID)測定化合物結(jié)構(gòu).
大氣壓化學(xué)電離(APCI)特點(diǎn)
大氣壓化學(xué)電離也是軟電離技術(shù),只產(chǎn)生單電荷峰,適合測定質(zhì)量數(shù)小于2000Da的弱極性的小分子化合物;適應(yīng)高流量的梯度洗脫/高低水溶液變化的流動相;通過調(diào)節(jié)離子源電壓控制離子的碎裂.
電噴霧與大氣壓化學(xué)電離的比較
電離機(jī)理:電噴霧采用離子蒸發(fā),而APCI電離是高壓放電發(fā)生了質(zhì)子轉(zhuǎn)移而生成[M+H]+或[M-H]-離子.
樣品流速:APCI源可從0.2到2 ml/min;而電噴霧源允許流量相對較小,一般為0.2-1 ml/min.
斷裂程度;APCI源的探頭處于高溫,對熱不穩(wěn)定的化合物就足以使其分解.
靈敏度:通常認(rèn)為電噴霧有利于分析極性大的小分子和生物大分子及其它分子量大的化合物,而APCI更適合于分析極性較小的化合物.
多電荷:APCI源不能生成一系列多電荷離子
NanoSpray 離子源
專門設(shè)計的 NanoSpray 離子源特別適合于做微量的生化樣品,其流速范圍可從
5nL/min到luL/min.一滴樣品就可做數(shù)小時的分析.可在最小的樣品消耗量下獲得最大靈敏度.靈敏度可高達(dá)fmole.并可直接與微孔HPLC聯(lián)用.
正負(fù)離子模式:
一般的商品儀器中,ESI和APCI接口都有正負(fù)離子測定模式可供選擇.
根據(jù)樣品的性質(zhì)選擇,也可兩種模式同時進(jìn)行
質(zhì)量分析器:
是質(zhì)譜儀中將離子按質(zhì)荷比分開的部分,離子通過分析器后,按不同質(zhì)荷比(M/Z)分開,將相同的M/Z離子聚焦在一起,組成質(zhì)譜.
質(zhì)量分析器的分類:
雙聚焦扇形磁場-電場串聯(lián)儀器(sector).
四極質(zhì)譜儀(Q).
飛行時間質(zhì)譜儀(TOF).
離子阱質(zhì)譜儀(TRAP)
付利葉變換-離子回旋共振質(zhì)譜儀(FT-ICRMS).
┏四極+TOF(Q-TOF)
串列式多級質(zhì)譜儀┫三重四極(QqQ)
(MS/MS)
┗TOF+TOF
進(jìn)行MS/MS的儀器從原理上可分為兩類
第一類儀器利用質(zhì)譜在空間中的順序,是由兩臺質(zhì)譜儀串聯(lián)組裝而成.即前面列出的串列式多級質(zhì)譜儀.
第二類利用了一個質(zhì)譜儀時間順序上的離子儲存能力,由具有存儲離子的分析器組成,如離子回旋共振儀(ICR)和離子阱質(zhì)譜儀.但不能進(jìn)行母離子掃描或中性丟失.
實驗室現(xiàn)有的質(zhì)量分析器類型:
串聯(lián)四極質(zhì)譜儀(MS/MS) :
三重四極(QqQ)
離子源→第一分析器→碰撞室→第二分析器→接收器
MS1 MS2
Q1 q2 Q3
QqQ儀器可以方便的改變離子的動能,因此掃描速度快,體積小,常作為臺式進(jìn)入常規(guī)實驗室,缺點(diǎn)是質(zhì)量范圍及分辨率有限,不能進(jìn)行高分辨測定,只能做到單位質(zhì)量分辨.(通過高分辨能得到化合物的分子式)
在液質(zhì)聯(lián)機(jī)中使用的碎片化手段,能量都是以碰撞的形式輸送給分子離子,這個能量足以使得處在能量亞穩(wěn)態(tài)分子中的某些化學(xué)鍵斷裂并使一些特定的分子發(fā)生結(jié)構(gòu)重排.
碰撞誘導(dǎo)解離CID質(zhì)譜:
選擇一定質(zhì)量的離子作為母體離子,進(jìn)入碰撞室,室內(nèi)充有靶子反應(yīng)氣體(碰撞氣體: N2,He,Ar,
Xe,CH4等)
,發(fā)生離子—分子碰撞反應(yīng),從而產(chǎn)生'子離子',再經(jīng)MS2的分析器及接受器得到子離子質(zhì)譜,一般稱做CID
(collision-induced dissociation)譜
影響CID質(zhì)譜的因素:
較大影響的因素有:所用碰撞氣體的種類,壓力,離子的能量,儀器的配置以及離子電荷狀態(tài)
由于在不同的儀器上不可能在完全相同的條件下去分析樣品,任何一個給定的化合物將在不同的條件下給出差別或大或小的質(zhì)譜,尤其是各個離子峰的相對豐度的差別幾乎是無法避免的.因而目前尚難以建立商品化的譜庫供檢索使用,只能進(jìn)行人工解析或自己建庫.
大氣壓電離技術(shù)中產(chǎn)生的離子為偶數(shù)電子離子,其主要的碎片應(yīng)由化學(xué)鍵的誘導(dǎo)斷裂和重排反應(yīng)來產(chǎn)生,所以在EI質(zhì)譜解析中總結(jié)出的偶數(shù)電子離子的開裂規(guī)則一般可適用于CID質(zhì)譜的解釋.
檢測接收器:
接收離子束流的裝置,有:電子倍增器,光電倍增器,微通道板
數(shù)據(jù)及供電系統(tǒng)
將接收來的電信號放大,處理并給出分析結(jié)果及控制質(zhì)譜儀個部分工作.
從幾伏低壓到幾千伏高壓.
LC-MS分析條件的選擇和優(yōu)化
1.接口的選擇:
ESI適合于中等極性到強(qiáng)極性的化合物分子,特別是那些在溶液中能預(yù)先形成離子的化合物和可以獲得多個質(zhì)子的大分子(如蛋白質(zhì))
APCI不適合可帶多個電荷的大分子,其優(yōu)勢在于弱極性或中等極性的小分子的分析.
2.正,負(fù)離子模式的選擇:
選擇的一般原則為:
正離子模式:適合于堿性樣品,可用乙酸或甲酸對樣品加以酸化.樣品中含有仲氨或叔氨時可優(yōu)先考慮使用正離子模式.
負(fù)離子模式:適合于酸性樣品,可用氨水或三乙胺對樣品進(jìn)行堿化.樣品中含有較多的強(qiáng)伏電性基團(tuán),如含氯,含溴和多個羥基時可嘗試使用負(fù)離子模式.
3.流動相的選擇
常用的流動相為甲醇,乙腈,水和它們不同比例的混合物以及一些易揮發(fā)鹽的緩沖液,如甲酸銨,乙酸銨等,還可以加入易揮發(fā)酸堿如甲酸,乙酸和氨水等調(diào)節(jié)pH值.
LC/MS接口避免進(jìn)入不揮發(fā)的緩沖液,避免含磷和氯的緩沖液,含鈉和鉀的成分必須送樣前一定要摸好LC條件,能夠基本分離,緩沖體系符合MS要求.
4.流量和色譜柱的選擇
不加熱ESI的最佳流速是1—50ul/min,應(yīng)用4.6 mm內(nèi)徑LC柱時要求柱后分流,目前大多采用 l—2.1
mm內(nèi)徑的微柱,TIS源最高允許lml/min,建議使用200—400ul/min
APCI的最佳流速～lml/min,常規(guī)的直徑4.6mm柱最合適.
為了提高分析效率,常采用< 100
mm的短柱(此時UV圖上并不能獲得完全分離,由于質(zhì)譜定量分析時使用MRM的功能,所以不要求各組分沒有完全分離).這對于大批量定量分析可以節(jié)省大量的時間.
5.輔助氣體流量和溫度的選擇
霧化氣對流出液形成噴霧有影響,干燥氣影響噴霧去溶劑效果,碰撞氣影響二級質(zhì)譜的產(chǎn)生.
操作中溫度的選擇和優(yōu)化主要是指接口的干燥氣體而言,一般情況下選擇干燥氣溫度高于分析物的沸點(diǎn)20℃
左右即可.對熱不穩(wěn)定性化合物,要選用更低的溫度以避免顯著的分解.
選用干燥氣溫度和流量大小時還要考慮流動相的組成,有機(jī)溶劑比例高時可采用適當(dāng)?shù)偷臏囟群土髁啃∫稽c(diǎn)的.
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