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金線蓮[臺灣銀線蘭Anoectochilus formosanus Hayata，花葉開唇蘭Anoectochilus roxhurghii （Wall.） Lindl.]為蘭科開唇蘭屬（金線蓮屬）Anoectochilus植物，是一種名貴珍稀的中草藥，具有清涼退火，涼血固肺，祛傷解毒，開中氣，滋補(bǔ)強(qiáng)壯之功效。但由于其繁殖率低，生長緩慢，加上近年來人們對金線蓮需求量猛增，導(dǎo)致過度采挖，使金線蓮的野生資源遭到嚴(yán)重破壞。臺灣己將金線蓮列入29種需要保護(hù)的稀有植物之一，福建省也將其列為省級野生藥材保護(hù)品種。由于金線蓮具有的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，在市場上供不應(yīng)求，目前金線蓮主要通過人工栽培，人工栽培模式主要有高標(biāo)準(zhǔn)示范大棚栽培和林下栽培。由于金線蓮生長條件獨(dú)特，栽培過程中容易引發(fā)嚴(yán)重的病蟲害，影響產(chǎn)量和品質(zhì)。其中白娟病是金線蓮較為常見的病害之一，白絹病又稱白霉病，該病主要危害植物靠近地面的莖基部和根部。 白絹病是由羅氏小核菌Sclero-tiumrolfsii Sacc.侵染引起，為蘭科植物世界性病害之一，該病多在春夏之交的梅雨季節(jié)以及秋雨連綿時(shí)發(fā)生，主要危害植物的根部及莖基部。白娟病為害藥用植物的研究，文獻(xiàn)報(bào)道較多的是白術(shù)白絹病，肖仲久等對白術(shù)白絹病病原菌進(jìn)行分子鑒定，采用6種培養(yǎng)基分別培養(yǎng)不同來源白術(shù)白絹病病原菌，并研究殺菌劑對不同種植區(qū)白術(shù)白絹病菌的毒力差異。目前對金線蓮白絹病的研究尚未見報(bào)道，現(xiàn)對金線蓮疑似白絹病標(biāo)樣進(jìn)行分離、純化及分子鑒定，以期從分子水平上確定疑似引起金線蓮白絹病的病原菌，為有效控制金線蓮白絹病的發(fā)生和危害提供參考依據(jù)。 一、材料與方法 1、試驗(yàn)材料 2012年5-9月，在前期調(diào)查福建省漳州市、三明市金線蓮種植企業(yè)疑似白絹病病情基礎(chǔ)上，采集金線蓮疑似白絹病病株，置于干凈的塑封袋中立即帶回實(shí)驗(yàn)室。 2、試驗(yàn)方法 2.1 病害調(diào)查和癥狀觀察 對金線蓮病株病害癥狀進(jìn)行觀察、記載和拍照。 2.2 病原菌分離純化 取病健交界處5mm左右的莖部組織，2.5%的次氯酸鈉表面消毒1min，無菌水沖洗3遍，用滅菌的濾紙吸干表面的水分，用解剖刀將莖段縱剖，將切面置于在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)。若有菌落形成，從菌落邊緣挑取菌絲轉(zhuǎn)接到新的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲得純培養(yǎng)菌落。同時(shí)取土表靠近金線蓮莖桿處的白色菌絲在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲得病原菌菌落。 2.3 病原菌形態(tài)學(xué)觀察及致病性檢側(cè) （1）形態(tài)學(xué)觀察 供試菌株置于PDA平板上培養(yǎng)，觀察菌落特征以及菌核形狀、大小、色澤，光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)。 （2）致病性 按照Koch氏法則，在PDA平板上接種分離純化得到的供試菌株，接種處周圍放置3-5根牙簽，25℃下培養(yǎng)，待牙簽上爬滿供試菌株菌絲后，將牙簽扎進(jìn)金線蓮莖基部。對照CK以無菌水浸泡的牙簽扎進(jìn)金線蓮莖基部，每處理重復(fù)3次。將各處理置于相同條件下培養(yǎng)，控制溫濕度，保證其發(fā)病條件，每天觀察記錄病害癥狀，等出現(xiàn)病害癥狀后取病株重新分離、鑒定。 2.4 供試菌株分子鑒定 （1）DNA提取 在PDA培養(yǎng)基（200g馬鈴薯、20g蔗糖、20g瓊脂和1000mI，蒸餾水，pHS.6-6.6）中對菌株活化培養(yǎng)，4-7d后，用滅菌器打孔，菌碟移入PS培養(yǎng)基中，28℃搖床內(nèi)150r/min振蕩培養(yǎng)5d。菌絲長到一定數(shù)量后挑出，置于滅菌濾紙內(nèi)用水過濾，并沖洗2-3次后，濾紙壓干后置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。DNA的提取按照改良的CTAB法。 （2）rDNA-ITS的擴(kuò)增 采用真菌ITS通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25μL，各組分如下：模板DNA 1μL（約30ng），10PCR Buffer 2.5μL，dNTP（10mmol/L）0.5μL，，引物ITS1和ITS4各1μL（10μmoI/L），TaqDNA聚合酶（2.5U/μL，）0.3μL，ddH2O 18.7μL，所用試劑除引物外，均購自Tiangen生化科技有限公司。 PCR擴(kuò)增在PTC-200型擴(kuò)增儀上完成，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃，預(yù)變性5min，然后94℃，1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30次循環(huán)，72℃延伸10min，4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，取5μL二擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，于凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）觀察、照相、保存。在紫外燈下從凝膠中切取目的條帶，經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒（TaKaRa）純化，送上海博尚生物技術(shù)公司基因測序。 獲得基因序列后，將菌株的rDNA-ITS序列與UenBank數(shù)據(jù)庫中己知序列進(jìn)行序列比對，并進(jìn)行同源性分析，結(jié)合病原菌的形態(tài)學(xué)觀察及致病}hT測定，最終確定病原菌的種類。 二、結(jié)果與分析 1、病害癥狀調(diào)查結(jié)果 白絹病對金線蓮生長危害嚴(yán)重，在春夏之交的梅雨季節(jié)，以及秋雨連綿時(shí)發(fā)生尤為嚴(yán)重，主要為害金線蓮根部及莖基部分。初發(fā)病時(shí)，在金線蓮基部接近土壤處出現(xiàn)水漬狀黃色病斑，后迅速擴(kuò)展至根部，隨后葉片萎蔫、莖桿呈褐色腐爛，容易折斷。嚴(yán)重時(shí)在病部產(chǎn)生白色絹絲狀菌絲，呈輻射狀延伸，并在根際土表蔓延。發(fā)病后期，菌絲體常交織形成初為白色，后漸變?yōu)辄S色，最終形成褐色圓形、菜籽狀菌核。 白絹病以菌絲體或菌核在病株殘?bào)w與盆土中生存。菌核對不良環(huán)境抵抗力極強(qiáng)，能在盆土中存活4-5年，并借病苗、病土和流水傳播。菌核萌發(fā)為菌絲后，可穿越土壤四處蔓延，接觸到蘭花植株后直接侵入或從傷口侵入，在高溫、高濕條件下發(fā)病較重。 2、病原菌形態(tài)特征與致病性檢測 2.1 病原菌形態(tài)特征 病健交界處分離純化得到的病原菌落與土表挑取的菌絲培養(yǎng)形成的菌落，菌落形態(tài)一致，都為菌絲白色，絨狀，緊貼培養(yǎng)基，生長速度快，向四周呈輻射狀擴(kuò)展。顯微鏡下觀察，菌絲有隔及分枝。培養(yǎng)5-6d后，菌落表面開始出現(xiàn)白色扭結(jié)，菌核形成，菌核除呈白色，后變黃色，最后變茶褐色，球形或不規(guī)則球形，表面光滑有光澤，直徑為0.5-1.0mm。   2.2 致病性觀察 金線蓮接種后第6d開始發(fā)病，病株病部出現(xiàn)暗褐色、濕潤狀、形狀不規(guī)則的病斑，稍凹陷，長出輻射狀白色絹絲狀菌絲體，最后整株枯萎死掉。取金線蓮感染病株重新進(jìn)行病原菌分離，又得到相同的病原菌。 3、rDNA-ITS區(qū)段擴(kuò)增及測序 用通用引物對白絹病病原菌的：DNA-ITS序列進(jìn)行擴(kuò)增，以該病原菌基因組DNA為模板，擴(kuò)增出約700bp的單一條帶。 4、同源性 用通用引物對白絹病病原菌的rDNA-ITS序列進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增出約700bp的特異性片斷。產(chǎn)物測序獲得的序列見圖3，將菌株的rDNA-ITS（GenBank）序列與GenBank中己有的DNA序列進(jìn)行同源性比較，數(shù)據(jù)顯示，同源性較高的菌株是羅氏小核菌，其相似性均達(dá)99%，因此，供試病原菌屬于羅氏小核菌，半知菌類真菌，這與前人研究結(jié)果一致。該菌株有性態(tài)為Athelia rolfsii（羅氏阿太菌）。   三、討論與結(jié)論 由羅氏小核菌侵染引起的植物病害在世界廣泛存在，該病原菌侵染植物后造成植物大量死亡減產(chǎn)，危害嚴(yán)重。福建省濕潤的氣候條件非常適宜名貴中草藥金線蓮的生長，但是隨著金線蓮種植面積的不斷擴(kuò)大和種植年限的延長，白絹病的危害嚴(yán)重影響著金線蓮的產(chǎn)量和質(zhì)量，威脅到金線蓮產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。因此，對該病害致病菌進(jìn)行快速、準(zhǔn)確鑒定是金線蓮白絹病病原菌研究和白絹病有效防治措施的重要課題，也是控制該病害發(fā)生、制定防治措施減少損害的先決條件。 傳統(tǒng)的真菌分類以形態(tài)特征和生理生化指標(biāo)為基礎(chǔ)，真菌的形態(tài)特征受環(huán)境影響，或者存在中間種等情況，使形態(tài)學(xué)鑒定存在不準(zhǔn)確性。利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)能直接反映基因本身，具有傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定無可比擬的準(zhǔn)確性。近年來，利用PCR擴(kuò)增病原菌核糖體ITS基因區(qū)段進(jìn)行病原菌鑒定、檢測及診斷的技術(shù)得到了很大的發(fā)展。 針對金線蓮白絹病病原菌的分子鑒定，國內(nèi)在這方面研究還未見報(bào)道，筆者利用16S-rDNA ITS序列進(jìn)行分析，鑒定出福建金線蓮主產(chǎn)區(qū)金線蓮白絹病致病菌為羅氏小核菌，羅氏小核菌的有性世代為羅氏阿太菌（Athelia rolfsii）是一種擔(dān)子菌，在本試驗(yàn)中未見到其有性態(tài)。 本研究從金線蓮病株上分離到病原菌，運(yùn)用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察與現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合，準(zhǔn)確鑒定出該病原菌為小菌核菌屬羅氏白絹小核菌。有文獻(xiàn)報(bào)道稱小菌核菌真菌在生活習(xí)性上與核盤菌屬真菌較為相似。核盤菌病原菌，常常危害植物莖基部，形成水浸狀病斑，在濕度大時(shí)病斑上長出白色菌絲，莖稈脆弱易斷，最后植株全株枯死。該真菌是危害向日葵的主要病害之一，向日葵終花期的花盤感此病時(shí)，花盤背面出現(xiàn)褐色水浸狀病斑，天氣多雨時(shí)蔓延迅速，穿透花盤，長出白色菌絲，整個(gè)花盤軟腐、脫落。菌核落在地上越冬，一般在土壤潮濕，溫度偏低及連作條件下發(fā)病重。小菌核菌真菌與核盤菌屬真菌目前正被研究用于殺除闊葉雜草，例如加拿大一枝黃花等，具有開發(fā)利用為生物除草劑的巨大潛力。
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