作者：林勵,歐劍鋒,廖觀榮,邱金裕,蔡岳文,肖鳳霞,李向明 

【摘要】  　　【目的】探討道地化橘紅藥材——毛橘紅形成原因?！痉椒ā坎捎酶咝б合?、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析、等離子發(fā)射光譜法分別分析不同產(chǎn)地化橘紅的柚皮苷含量、遺傳距離以及土壤中Al、K、Ca、Fe、Ti、B、Mg、Mn 8種元素豐度,并應(yīng)用SPSS 115統(tǒng)計(jì)軟件作相關(guān)性分析。【結(jié)果】產(chǎn)地土壤表土層Ca豐度對柚皮苷含量有顯著影響,心土層Al、K元素豐度差值與化橘紅遺傳距離呈顯著相關(guān)?！窘Y(jié)論】毛橘紅形成的原因可能與當(dāng)?shù)厥a(chǎn)的礞石有一定關(guān)系。

【關(guān)鍵詞】  化橘紅 柚皮苷/分析 道地性 色譜法,高壓液相

　　Abstract: ObjectiveTo explore the genuineness of Exocarpium Citri Grandis (ECG) from Huazhou city of Guangdong province.MethodsWe used the method of high performance liquid chromatography to detect the naringin content in ECG from different producing areas of Huazhou city. Random amplified polymorphic DNA analysis was used for the examination of genetic distance, and plasmaatomic emission spectrometry for the detection of soil elemental abundance of 8 elements such as aluminium (Al), kalium (K)，calcium (Ca)，ferrum(Fe),titanium(Ti),boron(B),magnesium(Mg),and manganese(Ma). The correlation of the above three parameters was analyzed by statistical software SPSS 115. ResultsCa abundance in the surface soil layer had an obvious effect on the content of naringin, and the difference of Al and K abundance in subsoil layer was correlated with the genetic distance of ECG. ConclusionThe genuineness of ECG is probably related with the abundance of phlopopitum in the soil of producing areas of Huazhou city．

　　Key words:EXOCARPIUM CITRL GRANDIS;NARINGIN/analysis;GENUINENESS;CHROMATOGRAPHY, HIGH PRESSURE LIQUID

　　化州柚Citrus grandis‘Tomentosa’為柚Citrus grandis的栽培變種,其外果皮為中藥化橘紅,由于密被絨毛,稱之為毛橘紅［1］,為治療痰證常用中藥。明代《本草原始》云：“橘紅,廣東化州者勝”。外果皮密被絨毛的柚——化州柚僅產(chǎn)于廣東省化州市,種植歷史已有千年［2］,為著名道地藥材。為了探明其形成原因,作者進(jìn)行了初步研究。現(xiàn)報(bào)道如下。

　　1　材料與方法

　　1.1　儀器P680A型高效液相色譜儀(德國Dionex),聯(lián)用自動進(jìn)樣器及二極管陣列檢測器，BS110型萬分之一電子分析天平(德國Sartorius)，DYY6C型電泳儀(北京市六一儀器廠)，15CSR型冷凍高速離心機(jī)(美國Beckman)，2400型聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(美國PE)，QR型純水儀(法國Millipore)，GDS7600型凝膠成像儀(英國UVP)，Spectra FLUOR plus多功能酶標(biāo)儀(瑞士TECAN)，SPECTRO CIROSCCD等離子發(fā)射光譜儀(德國)。

　　1.2　試劑甲醇(色譜純)，水(原子水)，石油醚(60℃～90℃)、醋酸、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉等試劑均為分析純，濃硝酸、氰氟酸、高氯酸試劑均為優(yōu)級純，柚皮苷對照品(自制,純度9812%)，野漆樹苷對照品(自制,純度9857%)，GoidVoew染料(北京賽百盛生物工程有限公司)，Agarose瓊脂糖( regular,西班牙Biowest)，SK2492型PCR擴(kuò)增試劑盒(上海生工生物工程有限公司)，100個隨機(jī)引物S1～S100(10個堿基,上海生工生物工程有限公司)，博彩3S柱離心式植物基因組DNA試劑盒(上海申能)。

　　1.3　樣品毛橘紅、光橘紅（柚果皮）等樣品均來自廣東化州市、廣州市(移栽品)及廣西陸川市(見表1),并經(jīng)廣東省中藥研究所丘金裕主任中藥師鑒定。表1　樣品來源、原植物形態(tài)及采樣點(diǎn)環(huán)境（略）

　　1.4　隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析化橘紅樣品的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析按照文獻(xiàn)［3］方法進(jìn)行。

　　1.5　柚皮苷含量及總黃酮指紋圖譜分析化橘紅樣品的柚皮苷含量測定及總黃酮指紋圖譜制備均按照文獻(xiàn)［4］方法進(jìn)行。

　　1.6　土壤元素豐度分析

　　1.6.1　土壤采樣在化橘紅原植物植株外圍進(jìn)行土壤采集,注意避開施肥圈對土樣帶來的影響。挖地深50 cm,用竹勺刮去表層土壤,以去除鐵鋤的鐵元素的影響。分段刮取土樣,表土層0～25 cm,心土層25～50 cm,各約1 kg。

　　1.6.2　土樣處理定量稱取土樣樣品于聚四氟乙烯塑料瓶中,加10 mL濃硝酸、10 mL氰氟酸和2 mL高氯酸,加熱溶解樣品,冷卻后定容,待測。

　　1.6.3　土樣測定調(diào)整等離子發(fā)射光譜儀狹縫刻度讀數(shù)(觀測高度15 mm,高頻發(fā)生器輸出功率為132 kW,反射功率< 5 W,溶液提升量26 mL/min)；氬氣流量：冷卻氣120 L/min、等離子氣10 L/min、載氣 10 L/min；積分時間為12 s；室溫為20 ℃；濕度為65%。分別測定Fe、Ti、Al、B、K、Mn、Mg、Ca 8種元素,分別以220350 nm或228802 nm為測定波長。

　　1.7　土樣元素豐度與化橘紅質(zhì)量及遺傳距離關(guān)系采用SPSS 115統(tǒng)計(jì)軟件,對樣品柚皮苷含量或遺傳距離與相對應(yīng)產(chǎn)地中豐度較高的Fe、Ti、Al、B、K、Mn、Mg、Ca元素分別進(jìn)行相關(guān)性分析,求得相關(guān)系數(shù)和P值。

　　2　結(jié)果

　　2.1　隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析結(jié)果

　　依法進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析研究,得不同引物擴(kuò)增圖譜,圖1和表2為引物S84擴(kuò)增圖譜及遺傳距離指數(shù)。表2結(jié)果顯示,柚與化州柚之間的遺傳距離并不大于不同產(chǎn)地化州柚之間的遺傳距離,產(chǎn)地間的生態(tài)因子的差異可顯著影響化州柚的遺傳距離。表2不同產(chǎn)地化橘紅遺傳距離指數(shù)比較（略）

　　2.2　柚皮苷含量及總黃酮指紋圖譜分析結(jié)果

　　依法進(jìn)行樣品柚皮苷含量及總黃酮指紋圖譜分析,柚皮苷含量結(jié)果見表3,總黃酮指紋圖譜以圖2(化州柚)和圖3(柚)為代表。結(jié)果顯示,野漆樹苷峰值化州柚顯著高于柚,形成了差異顯著的特征指紋圖譜。表3化橘紅樣品中柚皮苷含量（略）

　　2.3　土樣元素豐度分析結(jié)果

　　依法對土壤樣品相對應(yīng)產(chǎn)地中豐度較高的Fe、Ti、Al、B、K、Mn、Mg、Ca元素進(jìn)行豐度分析。結(jié)果見表4,各產(chǎn)地土壤表土層與心土層所測元素豐度大都相近,但不同產(chǎn)地土樣所測元素豐度可能存在差異。表4各產(chǎn)地土樣主要元素豐度測定結(jié)果（略）

　　2.4　各土樣中無機(jī)元素豐度與柚皮苷含量、遺傳距離關(guān)系分析

　　依法分別對各樣品的柚皮苷含量或遺傳距離與其相對主要元素豐度進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果見表5、表6。表5柚皮苷含量與產(chǎn)地土樣元素豐度的相關(guān)性，表6遺傳距離與產(chǎn)地土樣元素豐度差值的相關(guān)性（略）

　　表5結(jié)果顯示：土樣中無機(jī)元素豐度與樣品中柚皮苷含量多呈負(fù)相關(guān),但僅表土層土樣鈣元素豐度與柚皮苷含量間所呈現(xiàn)的負(fù)相關(guān)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<005)。

　　表6結(jié)果顯示：心土層土樣鋁元素和鉀元素的豐度差值均與遺傳距離呈正相關(guān),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<005或P<001)。

　　3　討論

　　化州柚是柚的栽培變種,屬于一種外果皮上有絨毛的柚,僅生長在廣東省化州市,與柚相比,化州柚在外觀形狀、顯微特征、化學(xué)成分等方面已出現(xiàn)顯著差異［3］,本研究結(jié)果也顯示兩者總黃酮指紋圖譜存在顯著差異,但其遺傳距離并不顯著大于不同產(chǎn)地化州柚之間的差異,可見產(chǎn)地間生態(tài)因素的差異可顯著影響化州柚的遺傳距離,提示該柚的栽培變種遺傳基因具有不穩(wěn)定的特性。

　　因此,本研究選點(diǎn)范圍集中在化州柚產(chǎn)地或周邊10 km內(nèi)的相鄰村鎮(zhèn),其氣候因子、地形因子、生物因子等大都相近。對土壤因子的初步研究結(jié)果顯示：土樣中無機(jī)元素豐度與樣品中柚皮苷含量多呈負(fù)相關(guān),但只有表土層土樣鈣元素豐度與柚皮苷呈顯著負(fù)相關(guān)(P<005)。提示生產(chǎn)中如大量施用石灰等含Ca元素豐富的肥料或農(nóng)藥,有可能會顯著影響化州柚果皮中柚皮苷含量。

　　研究結(jié)果還顯示：心土層土樣鋁元素豐度差值與遺傳距離呈極顯著正相關(guān)(P<001)。心土層鉀元素豐度差值與遺傳距離呈顯著正相關(guān)(P<005)。而其他元素豐度差值與遺傳距離均無顯著相關(guān)性(P>005)。初步表明土壤中鋁元素及鉀元素對化州柚基因有顯著影響。

　　化州柚產(chǎn)地多盛產(chǎn)中藥礞石,礞石為硅酸鹽類礦石,善治頑痰膠結(jié)阻肺之氣逆喘咳、痰積驚癇等證。礞石主要組成元素包括鋁和鉀元素,而本研究結(jié)果初步顯示,土壤心土層鋁、鉀元素對化州柚遺傳距離有顯著影響,提示化橘紅(毛橘紅)的道地性可能與當(dāng)?shù)厥a(chǎn)的礞石有一定關(guān)系,值得進(jìn)一步深入研究。