1 引言
　　角蛋白是脊椎動物上皮細(xì)胞最富有的蛋白，蛋白鏈以 α-螺旋或β-折疊結(jié)構(gòu)緊密聚合在一起，是皮膚及其附屬物如趾甲、毛發(fā)、羽毛的主要組成物。我國角蛋白資源極其豐富，其中羽毛廢棄物產(chǎn)量最多，年產(chǎn)量達(dá)70 多萬噸，尤其城市羽毛費(fèi)棄物堆積造成很大環(huán)境問題。

　　另一方面，羽毛角蛋白粗蛋白含量約80%以上，氨基酸含量70%以上，經(jīng)處理可以生產(chǎn)肽及稀有氨基酸而應(yīng)用在食品、飼料、化妝品等方面。目前羽毛角蛋白的處理方法主要有化學(xué)物理手段的傳統(tǒng)水解法和生物技術(shù)法，生物技術(shù)法較之傳統(tǒng)水解法具有諸多優(yōu)點(diǎn)，如反應(yīng)條件相對溫和、產(chǎn)物無損失，對環(huán)境污染小、可節(jié)省能源等。因此利用生物技術(shù)降解羽毛不僅解決了羽毛污染問題，變廢為寶，同時(shí)也節(jié)省能源，符合國家建立節(jié)約型社會和可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略要求。因此已成為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)，到目前為止，已發(fā)現(xiàn)30 余種微生物具有降解角蛋白的能力，除一些絲狀真菌外，主要有鏈霉菌[1, 2]，芽孢桿菌等。國內(nèi)近幾年也不斷降解羽毛微生物報(bào)道?，F(xiàn)在人們主要工作集中在角蛋白降解菌分離鑒定，以及其所產(chǎn)酶性質(zhì)研究上，關(guān)于該類菌工業(yè)化發(fā)酵研究還鮮有報(bào)道，而真正實(shí)踐中成功應(yīng)用的還沒有。本實(shí)驗(yàn)室分離篩選得到一株高效降解羽毛的菌株DHHJ（其可在48-72 小時(shí)內(nèi)將完整羽毛完全降解掉），前期初步研究了該菌株降解羽毛的酶學(xué)基礎(chǔ)，本文進(jìn)一步研究該菌株的發(fā)酵工藝，包括培養(yǎng)基、反應(yīng)pH 值、溫度、發(fā)酵時(shí)間等條件的優(yōu)化，同時(shí)對高效菌株與其它蛋白酶配伍降解羽毛最佳條件進(jìn)行初步的研究。為以后高效的水解工藝和裝置研究奠定基礎(chǔ)，也為羽毛角蛋白廢棄物的實(shí)際開發(fā)利用提供理論依據(jù)。中國醫(yī)學(xué)論文網(wǎng)專業(yè)提供醫(yī)學(xué)論文發(fā)表服務(wù)，并提供大量公共衛(wèi)生論文，如有業(yè)務(wù)需求請咨詢網(wǎng)站客服人員！

　　2 材料與方法
　　2.1 實(shí)驗(yàn)材料分離
　　于長期堆積腐爛羽毛的土壤，經(jīng)篩選得到的一株高效菌株，經(jīng)形態(tài)生理生化及分子鑒定為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌DHHJ(Stenotrophomonas maltophilia DHHJ)，以該菌株為本研究試材。雞毛粉(自制)：將市場得到的雞毛用洗滌劑清洗，再以清水充分洗凈，80 ℃烘干48 h，用粉碎機(jī)將其分別粉碎后，過100 目篩，備用。

　　2.2 實(shí)驗(yàn)測定方法
　　菌體濃度的測定：取離心后的發(fā)酵液1mL 加蒸餾水稀釋10-20 倍，以于600nm 波長處測定其吸光度。角蛋白酶活力的測定：角蛋白酶活力的測定方法參考Gradisar。酶活定義： pH7.8，40℃反應(yīng)1 小時(shí)后A280 值每增加0.1 為1 U。蛋白質(zhì)含量的測定：采用紫外分光光度法測定可溶性蛋白濃度。

　　2.3 發(fā)酵優(yōu)化的單因子試驗(yàn)
　　為了得到菌株最適降解羽毛效果發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件，本文以基本培養(yǎng)基（氯化鈉0.5g，磷酸氫二鈉∶磷酸二氫鉀 0.4∶0.03，羽毛粉 2g，pH 7.0）及基本培養(yǎng)條件(取活化后的培養(yǎng)液以1%的濃度比接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于35℃、120 轉(zhuǎn)/min 搖床培養(yǎng))為基礎(chǔ)分別進(jìn)行了下列培養(yǎng)因素（包括培養(yǎng)基組分及發(fā)酵條件）的單因子實(shí)驗(yàn)。

　　2.3.1 培養(yǎng)基成份優(yōu)化
　　基本培養(yǎng)基中羽毛粉的量分別設(shè)為 0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%；分別以2%的葡萄糖、甘油、蔗糖、糊精、水解糖、纖維二糖替換基本培養(yǎng)基中的可溶性淀粉；將基本培養(yǎng)基中的可溶性淀粉替換為葡萄糖，用量分別替換為0%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%、5%；在基本培養(yǎng)基中分別添加0.2% NH4Cl、(NH4)2HPO4、(NH4)2SO4、(NH4)2C2O4·H2O、蛋白胨、干酪素、牛肉浸膏；在基本培養(yǎng)基中分別添加0%、0.1%、0.2％、0.5%、1%的干酪素；在基本培養(yǎng)基中分別添加5 mmol/L 的下列無機(jī)鹽：MgCl2·6H2O、CaCl2、ZnCl2、KCl、FeCl3·6H2O、NaCl；在基本培養(yǎng)基中分別添加1 g/L 和4 g/L 的表面活性劑吐溫20、吐溫80 以及0.4 g/L 和1 g/L 的金屬鰲合劑乙二胺四乙酸(EDTA)。

　　2.3.2 培養(yǎng)條件
　　優(yōu)化用稀酸或稀堿溶液將基本培養(yǎng)基的起始 pH 值分別調(diào)至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，考察其對菌株DHHJ 發(fā)酵產(chǎn)酶和降解羽毛的影響；分別在250 mL 三角瓶中加入不同體積（25mL ~ 150 mL，25 mL 為一級）的基本培養(yǎng)基，考察不同裝液量對菌株DHHJ 發(fā)酵產(chǎn)酶和降解羽毛的影響；菌株DHHJ 分別在25 ℃、35 ℃、40 ℃、50 ℃的溫度下進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，考察溫度對菌株DHHJ 發(fā)酵產(chǎn)酶和降解羽毛的影響；在不同的發(fā)酵時(shí)間T=0~96 h（12 h 為一級）考察其對菌株DHHJ 發(fā)酵產(chǎn)酶和降解羽毛的影響。

　　2.3.3 條件優(yōu)化后對發(fā)酵結(jié)果影響
　　將菌株 DHHJ 接于基本培養(yǎng)基（氯化鈉0.5g，磷酸氫二鈉∶磷酸二氫鉀 0.4∶0.03，羽毛粉 2g，pH 7.0）并于35 ℃、120 rpm 培養(yǎng)；另取一定量優(yōu)化后種子液接種于最佳發(fā)酵培養(yǎng)基中并于最適發(fā)酵條件下恒溫培養(yǎng)。在不同的培養(yǎng)時(shí)間（0~96 h，12 h 為一級）測定比較兩者發(fā)酵液上清中的蛋白質(zhì)含量及酶活力。

　　2.4 蛋白酶水解發(fā)酵液正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)
　　為探索羽毛角蛋白廢棄物降解獲得蛋白質(zhì)和復(fù)合氨基酸的最佳方法與條件，由分離所得的菌株DHHJ 與蛋白酶配伍共同降解羽毛。實(shí)驗(yàn)采用L16(45)正交，菌株DHHJ 于上述優(yōu)化發(fā)酵條件下降解羽毛48h 后，通過改變蛋白酶種類、蛋白酶濃度、加入蛋白酶后的反應(yīng)時(shí)間這三個(gè)因素來考察兩者配伍降解羽毛的初步最佳條件。

　　3 結(jié)果與分析
　　3.1 發(fā)酵優(yōu)化的單因子試驗(yàn)
　　3.1.1 培養(yǎng)基成份優(yōu)化
　　在一定的范圍內(nèi)羽毛含量的增加對菌株 DHHJ 發(fā)酵產(chǎn)酶和降解羽毛起到促進(jìn)作用，說明羽毛對酶產(chǎn)生有一定的誘導(dǎo)作用。當(dāng)羽毛含量達(dá)到2.5%時(shí)，菌體濃度最大，酶活力最高，蛋白質(zhì)含量和氨基氮含量也都達(dá)到了最大值。但隨著羽毛含量的進(jìn)一步增加，各項(xiàng)指標(biāo)均有所下降，可能是羽毛的增加使培養(yǎng)基粘稠度增大，影響溶解氧的供給，降低了菌株DHHJ發(fā)酵產(chǎn)酶及降解羽毛的能力。

　　從不同碳源對菌株DHHJ 發(fā)酵產(chǎn)酶及羽毛降解的影響結(jié)果可知，選用葡萄糖作為碳源最適于菌株DHHJ 的生長，使其角蛋白酶活力明顯高于選用其它碳源時(shí)的酶活力，且在葡萄糖作為碳源的條件下菌株DHHJ 降解羽毛的能力也優(yōu)于其它，發(fā)酵液中蛋白質(zhì)含量比其它至少高出1 倍之多，氨基酸含量也高出至少23%。因此選擇用葡萄糖作為碳源，最佳碳源量為2%。

　　在含有羽毛粉為氮源的基本培養(yǎng)基中加入其他的不同含氮物質(zhì)(包括無機(jī)氮源和有機(jī)氮源)，發(fā)現(xiàn)菌株DHHJ 在不添加其它無機(jī)氮源的基本培養(yǎng)基中產(chǎn)酶和降解羽毛的效果最好，即羽毛粉作為唯一氮源時(shí)該菌株的生長最佳，酶活力為9.5 U，蛋白質(zhì)含量為10.43mg/mL。添加蛋白胨和牛肉膏反而蛋白質(zhì)含量和酶活力有所下降，而添加干酪素能增大蛋白質(zhì)含量和酶活力，當(dāng)干酪素含量為0.2%時(shí)，酶活力最大（11.5 U）。

　　通過在基本培養(yǎng)基中添加幾種常見的金屬離子，探討不同無機(jī)離子對菌株DHHJ 發(fā)酵產(chǎn)酶及羽毛降解的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：Na+對產(chǎn)酶有較為明顯的促進(jìn)作用，K+對產(chǎn)酶有促進(jìn)作用，而其他離子對產(chǎn)酶均有明顯的抑制作用。因此選擇在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加5mmol/L KCl 和5 mmol/L NaCl。

　　用250 mL 三角瓶中分別裝入不同體積的基本培養(yǎng)基，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)48h 后，測定發(fā)酵液的菌體濃度和上清液中蛋白質(zhì)、氨基酸含量及酶活力。結(jié)果表明，各項(xiàng)指標(biāo)均隨著裝液量的增加而降低，裝液量為25mL 時(shí)，菌株DHHJ 發(fā)酵產(chǎn)酶及降解羽毛效果最好，酶活為11.2 U，蛋白質(zhì)含量15.96 mg/mL，氨基酸含量0.36 mg/mL。該結(jié)果表明菌株DHHJ 為好氧菌，在發(fā)酵過程中需要通入足夠的氧氣來滿足其代謝生長。

　　細(xì)菌在生長過程中不僅受培養(yǎng)基組分及培養(yǎng)條件的影響，還受外加表面活性劑和高分子聚合物的影響。分別在基本培養(yǎng)基中添加不同濃度的表面活性劑吐溫20、吐溫80 及金屬鰲合劑乙二胺四乙酸(EDTA)，與不添加表面活性劑和聚合物對照，從結(jié)果中可以看出，除了吐溫80 能顯著提高產(chǎn)酶和菌株DHHJ 降解羽毛的效果外，添加其它不同濃度的物質(zhì)均抑制角蛋白酶的產(chǎn)生，而4 g/L 吐溫80 能極大地促進(jìn)該菌株產(chǎn)酶，使酶活提高75.78%左右。作為表面活性劑，它能改善發(fā)酵過程中氣液的交換，增強(qiáng)細(xì)胞膜的通透性，加快營養(yǎng)成分和代謝產(chǎn)物的輸出，從而大大提高羽毛降解的效果。因此選擇在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加4 g/L 的吐溫80。

　　3.1.2 培養(yǎng)條件
　　優(yōu)化起始 pH 對菌株DHHJ 發(fā)酵產(chǎn)酶及羽毛降解的影響較為顯著，當(dāng)pH 值為7.5 時(shí)，酶活最大（12.5 U）。起始pH 值在6.5~8.0 時(shí)，酶活力變化不大，但當(dāng)起始pH 值小于6.5 或大于8.0 時(shí)，酶活力明顯降低。由此可看出該菌株在偏堿性時(shí)對羽毛的降解效果較好，這與菌體濃度的變化趨勢一致。同時(shí)由蛋白質(zhì)和氨基酸含量與pH 值的關(guān)系可知，隨著pH 值的增大蛋白質(zhì)含量呈單調(diào)增長的趨勢，而當(dāng)pH 值為7.5 時(shí)氨基酸含量最大，為0.22 mg/mL。

　　其中，在pH 值大于7.5 時(shí)，蛋白質(zhì)含量與酶活力等其它指標(biāo)之間產(chǎn)生了分離，這可能是由于在不斷增加的堿性條件下羽毛角蛋白會產(chǎn)生部分堿解作用。

　　通過不同溫度對菌株DHHJ 發(fā)酵產(chǎn)酶及羽毛降解的影響可知，菌株DHHJ 發(fā)酵產(chǎn)酶的最適溫度是40 ℃，低于或高于40 ℃酶活力都迅速下降。而由蛋白質(zhì)和氨基酸的含量也可以看出，菌株DHHJ 降解羽毛的效果也是在35~40 ℃時(shí)最好，發(fā)酵液中蛋白質(zhì)含量最高達(dá)5.68 mg/mL，氨基酸含量最高達(dá)0.32 mg/mL。這與酶活力的變化相一致，低于35 ℃或高于40 ℃時(shí)，菌體濃度和酶活力都大大降低，影響羽毛的降解效果。

　　發(fā)酵時(shí)間對菌株DHHJ 產(chǎn)酶及羽毛降解的影響可以看出，發(fā)酵液的pH 值在0~72 h 內(nèi)隨發(fā)酵時(shí)間的增加而升高，之后又逐漸降低。菌體濃度、蛋白質(zhì)含量及酶活力在0~48 h 時(shí)均迅速升高，達(dá)到最大值，之后緩慢下降，至84 h 后又稍有回升?？赡苁窃?~48 h 之內(nèi)，pH 值在7.0~8.0 左右，有利于菌株DHHJ 生長，因此隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，菌株生長較為迅速，使得酶活力增大、降解羽毛能力增強(qiáng)，蛋白質(zhì)含量也隨之增大。但發(fā)酵液的pH 值不斷升高，48 h 后已達(dá)到8.0 并持續(xù)增大，不利于菌株的生長，抑制了角蛋白酶的產(chǎn)生，降低了酶活力，蛋白質(zhì)含量也隨菌株降解羽毛能力的下降而下降。

　　3.1.3 單因子試驗(yàn)優(yōu)化
　　前后產(chǎn)酶能力及降解羽毛能力對比單因子試驗(yàn)前后羽毛降解效果見，菌株DHHJ 在優(yōu)化發(fā)酵條件下的產(chǎn)酶能力及降解羽毛能力顯著高于未優(yōu)化發(fā)酵條件。其中，酶活力提高5.3 倍之多，蛋白質(zhì)含量提高約3.4 倍。對產(chǎn)酶能力而言，兩者的最大產(chǎn)酶高峰時(shí)間均出現(xiàn)在36~60 h 之間，但在優(yōu)化發(fā)酵條件下酶活力的增長速率遠(yuǎn)高于未優(yōu)化發(fā)酵條件。而對比蛋白質(zhì)含量可以看出，未優(yōu)化發(fā)酵條件下最大蛋白質(zhì)含量高峰出現(xiàn)時(shí)間較短，在36~60 h 之內(nèi)，且增幅不大，而在優(yōu)化發(fā)酵條件下12 后蛋白質(zhì)含量急劇上升，于24~72 h 內(nèi)出現(xiàn)高峰，始終較為平穩(wěn)。

　　3.2 菌株DHHJ 與蛋白酶配伍
　　降解羽毛為了提高羽毛降解產(chǎn)物中氨基酸的含量，進(jìn)而提高其利用附加值，本研究采用L16(45)正交表，考察蛋白酶種類、蛋白酶濃度、加入蛋白酶后的反應(yīng)時(shí)間這三個(gè)因素(分別以 A、B、C 表示)的影響。

　　可以看出，空白列的極差有時(shí)比單因素的極差大，這是由于菌株DHHJ 與蛋白酶配伍實(shí)驗(yàn)中可能還存在其它重要影響的因素，或者因素之間可能還有交互作用，所以下面僅對已挑選因素所做的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，還需做進(jìn)一步的研究。

　　根據(jù)極差大小排出的三個(gè)因素對三個(gè)指標(biāo)影響重要性的主次順序分別為：蛋白質(zhì)含量：

　　B>C>A；氨基酸含量：B>A>C。由極差分析結(jié)果，可確定各因素水平的最佳組合為：對蛋白質(zhì)含量來說：A4B4C2；對氨基酸含量來說：A2B4C2。

　　由于上述三個(gè)指標(biāo)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能達(dá)成一致，所以以下進(jìn)行綜合平衡以確定最佳方案。

　　因素A：對氨基酸含量來說是第二位的次要因素，取A2 最好；對蛋白質(zhì)含量取A4 最好，但由于A 對這個(gè)指標(biāo)是最次要的因素，所以綜合來看，因素A 可取A2。因素B：對兩個(gè)指標(biāo)來說，均以B4 為最佳水平，故取B4。因素C：對蛋白質(zhì)含量和氨基酸含量均取C2 最好，故取C2。

　　綜上所述可得菌株DHHJ 與蛋白酶配伍降解羽毛初步最佳方案為A2B4C2，即菌株DHHJ在最佳發(fā)酵條件下降解羽毛角蛋白48 h 后，再加入100 mg/mL 木瓜蛋白酶PS1 繼續(xù)降解反應(yīng)12 h。正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中沒有該種組合，所以對上述方案做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明在該種配伍條件下羽毛角蛋白降解更加徹底，蛋白質(zhì)含量達(dá)70.62 mg/mL，氨基酸含量達(dá)0.854 mg/mL，均高于正交實(shí)驗(yàn)中各組合，表明該模型降解羽毛來提高產(chǎn)物得率的方法是可行的。

　　4 討論
　　羽毛角蛋白是家禽加工企業(yè)最大的副產(chǎn)物，每年世界有幾百萬噸的廢棄羽毛被排放到環(huán)境中，造成了極大的環(huán)境處理壓力，另一方面，羽毛角蛋白含有豐富氨基酸而難以被利用。

　　產(chǎn)角蛋白酶微生物降解羽毛由于反應(yīng)條件溫和，成本低，無污染等優(yōu)點(diǎn)受到人們重視，現(xiàn)在已分離得到許多降解羽毛微生物（真菌、放線菌、細(xì)菌）。微生物降解羽毛工藝研究也已有一些初步研究，但均未實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。而羽毛廢棄物降解產(chǎn)物附加值低是該項(xiàng)技術(shù)難以工業(yè)化的一個(gè)重要原因。本研究中，我們不僅利用前期分離的降解羽毛細(xì)菌的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，而且研究了不同蛋白酶組合最適條件，提高降解液中氨基酸含量，提高其利用價(jià)值。據(jù)我們所知，這是降解羽毛研究的最為深入的一株革蘭氏陰性細(xì)菌。

　　發(fā)酵培養(yǎng)基成本及發(fā)酵過程能源消耗是決定一種微生物能否工業(yè)化應(yīng)用的關(guān)鍵因素，該菌經(jīng)過發(fā)酵條件優(yōu)化，得到最適培養(yǎng)基(g/100 mL)為：葡萄糖1 g、羽毛粉2.5 g、干酪素0.2g、KCl 0.0373 g、NaCl 0.0294 g 、吐溫80 0.4 g、磷酸氫二鈉∶磷酸二氫鉀=0.4：0.03、pH7.5。

　　最適發(fā)酵條件為：裝液量25 mL/250 mL、溫度40 ℃，在該發(fā)酵條件下，發(fā)酵時(shí)間48-72 h內(nèi)雞毛能被完全降解。目前發(fā)現(xiàn)的大部分羽毛降解菌都為嗜熱微生物，應(yīng)用時(shí)耗能高。而本研究的菌株培養(yǎng)條件溫和，發(fā)酵時(shí)間短，所需培養(yǎng)基成份簡單，羽毛可以作為氮源及部分碳源，這些都決定了其工業(yè)化應(yīng)用成本低，因此具有潛在開發(fā)價(jià)值。

　　羽毛降解產(chǎn)物可溶性蛋白含量高，游離氨基酸含低，導(dǎo)致水解產(chǎn)物作為飼料、肥料應(yīng)用且效果不穩(wěn)定，商業(yè)價(jià)值不大，因而在實(shí)踐中難以推廣應(yīng)用。本文通過將羽毛降解產(chǎn)物與其它蛋白酶正交實(shí)驗(yàn)，得出最適酶解條件，提高了發(fā)酵液中可溶性氨基本含量，進(jìn)一步研究表明其對頭發(fā)、羊毛有很好的增重、增強(qiáng)及定型效果（另文報(bào)道），拓寬了其應(yīng)用范圍，提高了該技術(shù)產(chǎn)物附加值。