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選修1 生物技術(shù)實踐 微生物的利用 一．微生物實驗室培養(yǎng) 1．培養(yǎng)基 1.1概念 按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)。固體（加凝固劑瓊脂）、液體。 1.2成分 水、無機鹽、碳源（有機、無機碳源）、氮源（有機、無機氮源）、生長因子（維生素）。 例如：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基成分： 牛肉膏（碳源、磷酸鹽、維生素）、蛋白胨（氮源、維生素）、NaCl（無機鹽）、H2O（H、O元素）。 1.3滿足條件 PH：霉菌（酸性）、細(xì)菌（中性、微堿性） O2：醋酸菌（需氧）、乳酸菌（厭氧） 特殊物質(zhì)：乳酸菌需要加入維生素 2．牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基制備 計算---稱量---溶化---滅菌---倒平板（培養(yǎng)基50℃時倒平板、冷凝后，平板倒置---水分揮發(fā)、防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。） 將滅菌的培養(yǎng)基放入37℃的溫室中培養(yǎng)24—48小時，以檢查滅菌是否徹底。 1.以下關(guān)于制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基的敘述錯誤的是（ A ） A．操作順序為計算、稱量、溶化、倒平板、滅菌 B．將稱好的牛肉膏連同稱量紙一同放入燒杯 C．待培養(yǎng)基冷卻至 D．待平板冷卻凝固約5～10 min后將平板倒過來放置 解析：制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基的步驟是計算、稱量、溶化、滅菌、倒平板，不能顛倒。牛肉膏容易吸潮，所以當(dāng)牛肉膏溶化并與稱量紙分離后，用玻棒取出稱量紙。待培養(yǎng)基冷卻至 3．純化大腸桿菌 3.1 平板劃線法 ①每次劃線前和結(jié)束都要灼燒接種環(huán) ②灼燒后等冷卻進行劃線 ③從上次劃線末端開始劃線 ④在火焰旁接種劃線 3.2 稀釋涂布平板法 將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋的菌液進行一系列的梯度稀釋。 （2）涂布平板 將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進行培養(yǎng)。在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將被分散成單個細(xì)胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個的菌落。 將接種后的培養(yǎng)基和一個未接種的培養(yǎng)基都放入37℃恒溫箱中，培養(yǎng)12h和24h后，分別觀察并記錄結(jié)果。 注意：酒精燈與培養(yǎng)皿距離合適，吸管頭不要接觸任何其他物體，吸管要在酒精燈火眼周圍等。 二．土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計數(shù) 1.土壤取樣、選擇培養(yǎng)基
2.統(tǒng)計菌落數(shù)目 ①計數(shù)： 選擇長有30~300個菌落的平板計數(shù)，同一稀釋度的三個重復(fù)的菌數(shù)不能相差很懸殊。 ②計算： 每樣品中的菌株數(shù)=（同一稀釋度三次重復(fù)的菌落平均數(shù)÷涂布平板時所用稀釋液的體積）×稀釋倍數(shù) ③鑒定分解尿素的細(xì)菌 在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果PH升高，指示劑將變紅。 注意： 分離不同的微生物要采用不同的稀釋度，測定土壤中細(xì)菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細(xì)菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍不同。 2.尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)肥料，但若不經(jīng)細(xì)菌的分解，就不能更好地被植物利用。生活在土壤中的微生物種類和數(shù)量繁多，同學(xué)們試圖探究土壤中微生物對
尿素是否有分解作用，設(shè)計了以下實驗，并成功篩選到能高效降解尿素的細(xì)菌（目的菌）。培養(yǎng)基成分如表所示，實驗步驟如下。請分析回答問題： （1）這種培養(yǎng)基屬于選擇培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基能否用于植物組織培養(yǎng)？不能 ，理由是缺少植物激素（缺少植物生長需要的各種營養(yǎng)）。 （2）“目的菌”生長所需的氮源和碳源分別來自培養(yǎng)基中的尿素 和葡萄糖 ，實驗需要振蕩培養(yǎng)，原因是為目的菌提供氧氣。 （3）轉(zhuǎn)為固體培養(yǎng)時，常采用稀釋涂布平板法（平板劃線法）的方法接種，獲得單菌落后繼續(xù)篩選。 （4）在進行分離分解尿素的細(xì)菌實驗時，A同學(xué)從培養(yǎng)基上篩選出大約150個菌落，而其他同學(xué)只選擇出大約50個菌落。A同學(xué)的實驗結(jié)果產(chǎn)生的原因可能有：土壤取樣不同、培養(yǎng)基有污染（操作方法失誤） （5）簡述土壤中可分解尿素細(xì)菌的鑒定方法及原理： 在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑 ，細(xì)菌合成的脲酶將尿素分解為氨，PH增高，使酚紅指示劑變紅色 （6）實驗結(jié)束后，使用過的培養(yǎng)基應(yīng)該進行滅菌處理后，才能倒掉。 三．分解纖維素的微生物的分離 1.方法---剛果紅（CR）篩選法 篩選原理：剛果紅可以與像纖維素這樣的多糖物質(zhì)形成紅色復(fù)合物，但并不和水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應(yīng)。 2. 實驗方案 （1）土壤取樣（選擇富含纖維素菌的環(huán)境） （2）選擇培養(yǎng) ①目的：增加纖維素分解菌的濃度，以確保能夠從樣品中分離到所需要的微生物。 ②制備選擇培養(yǎng)基：富含纖維素粉的液體培養(yǎng)基（參照課本旁欄中的比例配制）。 ③選擇培養(yǎng)：稱取土樣 （3）梯度稀釋 參照專題1的稀釋操作，依次將培養(yǎng)液稀釋101～107倍。 （4）將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上 （5）挑選產(chǎn)生透明圈的菌落 參照課本剛果紅染色法，挑選產(chǎn)生有透明圈的菌落，一般即為分解纖維素的菌落。 3．生物乙醇是以生物為原料生產(chǎn)的可再生能源。我國利用農(nóng)作物廢棄物（秸稈）生產(chǎn)乙醇，其技術(shù)流程為：纖維素酶解→酵母發(fā)酵→蒸餾→成品。 （1）纖維素酶的成本能否下降，是能否實現(xiàn)乙醇工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵因素。纖維素酶可以從能分解纖維素的細(xì)菌培養(yǎng)液中提取。某同學(xué)設(shè)計了如下分離土壤中纖維素分解菌的實驗流程：土壤取樣→選擇培養(yǎng)→梯度稀釋→鑒別培養(yǎng)。 ①最好選擇怎樣的環(huán)境采集土樣? 選擇纖維素豐富的土壤環(huán)境。 ②以下是一種培養(yǎng)基配方：纖維素粉 ③為了鑒別纖維素分解菌和進一步純化菌種，可以在鑒別培養(yǎng)基上加入剛果紅 染液，將篩選獲得的菌液稀釋后用涂布平板法 方法接種到鑒別培養(yǎng)基上，然后挑選產(chǎn)生透明圈的菌落作為菌種進行擴大培養(yǎng)。 ④纖維素分解菌培養(yǎng)液中的纖維素酶產(chǎn)量如何呢?請設(shè)計實驗進行檢測。向定量纖維素分解菌培養(yǎng)液中加入定量纖維素，定時測定葡萄糖產(chǎn)量的變化。 （2）乙醇是酵母菌的發(fā)酵產(chǎn)物。發(fā)酵時酵母菌直接利用的物質(zhì)是葡萄糖(或纖維素酶解產(chǎn)物)。 （3）發(fā)酵時乙醇濃度升高會對酵母菌產(chǎn)生毒性，從而影響進一步的發(fā)酵?？茖W(xué)家利用基因工程方法創(chuàng)造出一種對乙醇濃度有高耐受力的酵母菌新菌種，該過程需采用PCR技術(shù)擴增目的基因。與體內(nèi)DNA復(fù)制相比，PCR反應(yīng)體系需加入哪兩種特別的物質(zhì)? 兩種引物、耐熱的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)。 生物技術(shù)在食品加工及其他方面的應(yīng)用 一．運用發(fā)酵加工食品的基本方法 知識整合 1.幾種發(fā)酵菌種的比較
2.果酒、果醋制作、腐乳制作、泡菜制作的比較
（1）從制酒和制醋兩階段對裝置的處理方式判斷，酵母菌和醋酸桿菌的異化作用類型依次是______________。 （2）同學(xué)甲在制酒階段，每隔12 h左右就要將瓶蓋擰松一次，但又打不開，這樣做的目的是________________________________。用反應(yīng)式表示出制酒過程剛開始時發(fā)生的主要化學(xué)變化：____________________________________________ （3）B裝置中排氣口要通過一個長而彎曲的膠管與瓶身相連，這樣做的原因是__________________________________。 （4）制葡萄酒時要將溫度控制在18～25℃，而制葡萄醋要將溫度控制在30～35℃，原因是____________________________________。葡萄汁為酵母菌、醋酸桿菌等微生物的生長提供的營養(yǎng)成分是________。 （5）制作過程一般不需要額外添加酵母菌和醋酸桿菌即可完成。為了提高果酒品質(zhì)也可以向果汁中加入人工培養(yǎng)的酵母菌。利用________培養(yǎng)基可分離獲得較為純凈的酵母菌種。 答案：(1)兼性厭氧型、需氧型 (2)制酒階段的后期，酵母菌無氧呼吸會產(chǎn)生大量氣體，如不及時放出會把瓶子或瓶蓋脹破，不打開瓶蓋是防止氧氣和有害雜菌進入 C6H12O6＋6H2O＋6O2――→酶6CO2＋12H2O＋能量 (3)防止污染 (4)18～25 ℃是酵母菌生長和發(fā)酵的合適溫度，30～35 ℃是醋酸桿菌生長和發(fā)酵的合適溫度 碳源、氮源、水、無機鹽等 (5)選擇 2.豆腐乳的品種很多，紅方腐乳因加入紅曲而呈紅色，味厚醇香；糟方腐乳加入酒糟而糟香撲鼻；青方腐乳不加輔料，用豆腐本身滲出的水加鹽腌制而成。豆腐乳的品種還會因豆腐的含水量、酒的種類和用量等因素而不同。就腐乳制作回答下列問題： （1）腐乳制作有多種微生物參與，其中起主要作用的是________。 （2）豆腐發(fā)酵主要利用了微生物產(chǎn)生的________，通過發(fā)酵，豆腐中營養(yǎng)物質(zhì)的種類________，且更易于消化和吸收。 （3）在腐乳制作過程中，抑制微生物的物質(zhì)有鹽、________、________等。 （4）含水量為________左右的豆腐適于制作腐乳，若你完成了腐乳制作，可以從________等方面評價乳腐的質(zhì)量。 答案 (1)毛霉 (2)蛋白酶等酶類 增多 (3)酒 香辛料 (4)70% 色澤、口味、塊形等 二．蛋白質(zhì)的提取和分離 一．原理 1．凝膠色譜法（分配色譜法）： （1）原理：分子量大的分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動快；分子量小的分子穿過多孔凝膠顆粒內(nèi)部，路程長，流動慢。 （2）凝膠材料：多孔性，多糖類化合物，如葡聚糖、瓊脂糖。 （3）分離過程： 混合物上柱→洗脫→大分子流動快、小分子流動慢→收集大分子→收集小分子 洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流動。 2．緩沖溶液 （1）原理：由弱酸和相應(yīng)的強堿弱酸鹽組成（如H2CO3－NaHCO3，HC－NaC，NaH2PO4/Na2HPO4等），調(diào)節(jié)酸和鹽的用量，可配制不同pH的緩沖液。 （2）緩沖液作用：抵制外界酸、堿對溶液pH的干擾而保持pH穩(wěn)定。 3．凝膠電泳法： （1）原理：不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、電量、形狀和大小不同，在電場中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在電場中的運動方向和運動速度不同。 （2）分離方法：瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。 （3）分離過程：在一定pH下，使蛋白質(zhì)基團帶上正電或負(fù)電；加入帶負(fù)電荷多的SDS，形成“蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物”，使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子大小。 二、實驗步驟 1．樣品處理 ①紅細(xì)胞的洗滌 洗滌紅細(xì)胞的目的是去除雜蛋白，采集的血樣要及時采用低速短時間離心分離紅細(xì)胞，然后用膠頭吸管吸出上層透明的黃色血漿，將下層暗紅色的紅細(xì)胞液體倒入燒杯，再加入五倍體積的生理鹽水，緩慢攪拌10min，低速短時間離心，如此重復(fù)洗滌三次，直至上清液中沒有黃色，表明紅細(xì)胞已洗滌干凈。 ②血紅蛋白的釋放 在蒸餾水和甲苯作用下，紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。 注：加入蒸餾水后紅細(xì)胞液體積與原血液體積要相同。加入甲苯的目的是溶解細(xì)胞膜，有利于血紅蛋白的釋放和分離。 2．粗分離 ①分離血紅蛋白溶液 將攪拌好的混合溶液離心后，試管中的溶液分為4層。第一層為無色透明的甲苯層，第2層為白色薄層固體，是脂溶性物質(zhì)的沉淀層，第3層是紅色透明液體，這是血紅蛋白的水溶液，第4層是其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物。將試管中的液體用濾紙過濾，除去之溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。 ②透析 取1mL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300mL的物質(zhì)的量的濃度為20mmol/L的磷酸緩沖液中，透析12h。透析可以去除樣品中分子量較小的雜質(zhì)，或用于更換樣品的緩沖液。 3．純化 調(diào)節(jié)緩沖液面：打開色譜柱下端的流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到與凝 ↓ 膠面平齊，關(guān)閉出口。 加入蛋白質(zhì)樣品：用吸管將透析后的樣品沿管壁環(huán)繞移動加到色譜柱的頂端。加樣后， ∣ 打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全滲入凝膠層后， ↓ 關(guān)閉出口。 調(diào)節(jié)緩沖液面：加入20mmol/L的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度 ↓ 洗脫：連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口，進行洗脫。 ↓ 收集分裝蛋白質(zhì)：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時，用試管收集。 4.純度鑒定------SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（選做） 三、注意事項 1.電泳技術(shù) 電泳技術(shù)就是在電場的作用下，利用待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而達到對樣品進行分離、鑒定或提純的目的。 2. 紅細(xì)胞的洗滌 如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和時間過長，會使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。 3．如何檢測凝膠色譜柱的裝填是否成功 如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時要重新裝柱。 4．G-75 “G”代表凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍，75表示凝膠得水值，即每克凝膠膨脹時吸水 5．裝填完后，立即用洗脫液洗脫的目的：使凝膠裝填緊密 6．加入檸檬酸鈉有何目的？為什么要低速、短時離心？為什么要緩慢攪拌？ 防止血液凝固；防止白細(xì)胞沉淀；防止紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。 三．PCR技術(shù)的基本操作和應(yīng)用 過程：PCR的反應(yīng)過程 ①變性：在 ②復(fù)性：在 ③延伸：在 PCR需在一定的緩沖溶液中才能進行，需提供：DNA模板、兩種引物、脫氧核苷酸、耐熱的DNA聚合酶，同時控制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進行。 1.關(guān)于DNA的復(fù)制，下列敘述正確的是（ C ） A. DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從 B. DNA復(fù)制不需要引物 C. 引物與DNA母鏈通過堿基互補配對進行結(jié)合 D. DNA的合成方向總是從子鏈的 2．“X基因”是DNA分子上一個有遺傳效應(yīng)的片段，若要用PCR技術(shù)特異性地拷貝“X基因”，需在PCR反應(yīng)中加入兩種引物，兩種引物及其與模板鏈的結(jié)合位置如圖1所示。經(jīng)4輪循環(huán)后產(chǎn)物中有五種不同的DNA分子，如圖2所示，其中第⑤種DNA分子有幾個 （ D ） A.2 B.4 C.6 D.8 解析：第一次循形成①和②，第二次循環(huán)①形成①③，②形成②④4個DNA，第三次循環(huán)①形成①③，③形成③⑤；②形成②④，④形成④⑤。4次循環(huán)后共形成16分子DNA，其中①、②各一分子，③、④各三分子，⑤共8分子。 |
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