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常用染色液的配制
１．染料飽和酒精溶液的配制 配制染色液常先將染料配成可長期保存的飽和酒精溶液，用時再予以稀釋配制。配制飽和酒精溶液，應(yīng)先用少量95％酒精先在研缽中徐徐研磨，使染料充分溶解，再按其溶解度加于95％酒精之中，貯存于棕色瓶中即可。
附表1 幾種常用染料在95%酒精中的溶解度(26℃)
染料名稱 美 藍 結(jié)晶紫 龍膽紫 堿性復(fù)紅 沙黃 溶100mL95％酒精中的重量(g) 1.48 13.87 10.00 3.20 3.41 2．常用染色液的配制 （１）堿性美藍(亦稱駱氏美藍)染色液：取美藍飽和酒精溶液30ml，加入0.01％氫氧化鉀水溶液l00mL，混合即成。此染色液在密閉條件下可保存多年。若將其在瓶中貯至半滿，松塞棉塞，每日拔塞搖振數(shù)分鐘，并不時加水補充失去的水分，約1年后可獲得多色性，成為多色美藍染色液。 （２）草酸銨結(jié)晶紫(亦稱赫克結(jié)晶紫)染色液：取結(jié)晶紫飽和酒精溶液2mL，加蒸餾水18mL稀釋10倍，再加入1％草酸銨水溶液80mL，混合過濾即成。 （３）革蘭氏碘溶液：將碘化鉀2g置乳缽中，加蒸餾水約5mL。再加入碘片1g，予以研磨，并徐徐加水，至完全溶解后，注入瓶中，被加蒸餾水至全量為300mL即成。此液可保存半年以上，當(dāng)產(chǎn)生沉淀或褪色后即不能再用。 （４）沙黃水溶液：沙黃也稱番紅花紅。將沙黃飽和酒精溶液以蒸餾水稀釋10倍即成。此液保存期以不超過4個月為宜。 （５）石炭酸復(fù)紅染色液：取3%復(fù)紅酒精溶液10mL，加入5％石炭酸水溶液90mL混和過濾即成。 （６）稀釋石炭酸復(fù)紅染色液：將石炭酸復(fù)紅染色液以蒸餾水稀釋10倍即成。 （７）3％鹽酸酒精(亦稱含酸酒精)：加濃鹽酸3mL于95%酒精97mL中即成。 （８）瑞士染色色液：取瑞氏染料0.1g置乳缽中，徐徐加入甲醇，研磨以促其溶解。將溶液傾入有色中性玻瓶中，并數(shù)次以甲醇洗滌乳缽，亦傾入瓶內(nèi)，最后使全量為60mL即可。將此瓶置暗處過夜，次日濾過即成。此染色液須置于暗處，其保存期約為數(shù)月。 （９）姬姆薩染色液 取姬姆薩氏染料0.6g加于甘油50mL中，置55~60℃水浴中1.5~2h后，加入甲醇50mL，靜置1日以上，濾過即成姬姆薩染色液原液。 臨染色前，于每毫升蒸餾水中加人上述原液1滴，即成姬姆薩染色液。應(yīng)當(dāng)注意，所用蒸餾水必須為中性或微堿性，若蒸餾水偏酸，可于每l0mL左右蒸餾水加入1％碳酸鉀溶液l滴，使其變成微堿性。
特殊染色法
1．莢膜染色法 （１）美藍染色法：帶負電荷的菌體與帶正電荷的堿性染料結(jié)合成藍色，而莢膜因不易著色而染成淡紅色。抹片自然干燥，甲醇固定，以久儲的多色性美藍液作簡單染色，莢膜呈淡紅色，菌體呈藍色。 注：多色性美藍即堿性美藍，亦稱駱氏美藍。 （２）瑞氏染色法或姬姆薩染色法：抹片自然干燥，甲醇固定，以瑞氏染色液或姬姆薩染色液染色，莢膜呈淡紫色，菌體呈藍色。 （３）節(jié)氏(Jasmin)莢膜染色法：取9mL含有0.5％石炭酸的生理鹽水，加入lmL無菌血清(各種動物的血清均可)混合后成為涂片稀釋液。取此液一接種環(huán)置于載玻片上，又以接種環(huán)取細菌少許，均勻混懸其中，涂成薄層，任其自然干燥，在火焰上微微加熱固定，然后置甲醇中處理，并立即取出，在火焰上燒去甲醇。以革蘭氏染色液中的草酸銨結(jié)晶紫染色液染色0.5min，干燥后鏡檢。背景淡紫色，菌體深紫色，莢膜無色。 2．鞭毛染色法 （１） 萊氏(Leifson)鞭毛莢膜染色法 鞭毛寬一般約0.01~0.05微米，在普通光學(xué)顯微鏡下看不見，用特殊染色法在染料中加入明礬與鞣酸作媒染劑，讓染料沉著于鞭毛上，使鞭毛增粗容易觀察，染色時間愈長，鞭毛愈粗。 染色液：
鉀明礬或明礬的飽和水溶液
20％鞣酸水溶液
蒸餾水
95％酒精
堿性復(fù)紅飽和酒精溶液
依上列次序?qū)⒏饕夯旌?，置于緊塞玻瓶中，其保存期為1個星期。 染色劑：
含染料90％的美藍
硼砂(Borax) 蒸餾水 100mL 染色法：滴染色液于自然干燥的抹片上，在溫暖處染色l0min，若不作莢膜染色，即可水洗，自然干燥后鏡檢。鞭毛呈紅色；若作莢膜染色，可再滴加復(fù)染劑于抹片上，再染色5~l0min，水洗，任其干燥后鏡檢。莢膜呈紅色，菌體呈藍色。 （２）劉榮標氏鞭毛染色法 染色液： 溶液一： 5％石炭酸溶液 l0mL 鞣酸粉末 2g 飽和鉀明礬水溶液 l0mL 溶液二：飽和結(jié)晶紫或龍膽紫酒精溶液。 用時取溶液一10份和溶液二l份，此混合液能在冰箱中保存7個月以上。 染色法：取幼齡培養(yǎng)物制成抹片，干燥及固定后以溶液一和溶液二的混合液在室溫中染色2~3min，水洗，干燥后鏡檢。菌體和鞭毛均呈紫色。 （３）卡-吉二氏(Casares-Cill)鞭毛染色法 媒染劑： 鞣酸 10g 氯化鉛(AICl3·6H20) 18g 氯化鋅(ZnCl2) l0g 鹽酸玫瑰色素(Rosanilline hydrochloride)或堿性復(fù)紅 1.5g 60％酒精 40mL 先盛60％酒精10mL于乳缽中，再以上列次序?qū)⒏魑镏萌槔徶醒心ヒ约铀倨淙芙?，然后徐徐加入剩余的酒精。此溶液可在室溫中保存?shù)年。此法染假單胞菌更好。 染色法：制片自然干燥后，將上述媒染劑作1：4稀釋，濾紙過濾后滴于片上染2min。 水洗后加石炭酸復(fù)紅染5min，水洗，自然干燥，鏡檢。菌體與鞭毛均呈紅色。 3．芽孢染色法 （１）復(fù)紅美藍染色法：細菌的芽孢外面有較厚的芽孢膜，能防止一般染料的滲入，如用堿性復(fù)紅、美藍等作簡單染色，芽孢不易著色。采用對芽孢膜有強力作用的化學(xué)媒染劑如石炭酸復(fù)紅進行加溫染色，芽孢著色牢固，一旦芽孢著色后，于酸類溶液處理也難使之脫色，因此再用堿性美藍溶液復(fù)染，只能使菌體著色。 抹片經(jīng)火焰固定后，滴加石炭酸復(fù)紅液于片上，加熱至生蒸汽，經(jīng)2~3min，水洗。以5％醋酸脫色，至淡紅色為止，水洗。以駱氏美藍液復(fù)染0.5min，水洗。吸干或烘干，鏡檢，菌體呈藍色，芽孢呈紅色。 （２）孔雀綠—沙黃染色法：抹片經(jīng)火焰固定后滴加5％孔雀綠水溶液于其上，加熱30~60s,使生蒸汽3~4次。水洗0.5min，以0.5％沙黃水溶液復(fù)染0.5min。水洗，吸干鏡檢。菌體呈紅色，芽孢呈綠色(所用玻片最好先以酸液處理，可防綠色褪色)。 4．異染顆粒染色法 異染顆粒的主要成分是核糖核酸和多偏磷酸鹽，嗜堿性強，故用特殊染色法可染成與細菌其他部分不同的顏色。 （１）美藍染色法：抹片在火焰中固定后，以多色性美藍染色0.5min，水洗，吸干，鏡檢。菌體呈深藍色，異染顆粒呈淡紅色。 （２）亞氏（Albert）染色法：抹片在火焰中固定后，以亞氏染色液染色5min,水洗后再以碘溶液染色1min,水洗，吸干，鏡檢。菌體呈綠色，異染顆粒呈黑色。 亞伯特氏染色液和碘溶液的成分如下： 染色液： 甲苯胺藍(Toludine blue) 0.15g 孔雀綠 0.20g 冰醋酸 lmL 95％酒精 2mL 蒸餾水 l00mL 碘溶液： 碘片 2g 碘化鉀 3g 蒸餾水 300ml 將碘片和碘化鉀在乳缽中研磨，先加40~50mL水，使其充分溶解，然后再加足量蒸餾水。 |
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