菌種純化和保存

duanbaoyan 2011-03-31

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求助菌種純化和保存的問題

第一節(jié) 微生物的分離和純培養(yǎng)
一、無菌技術(shù)
　　微生物通常是肉眼看不到的微小生物，而且無處不在。因此，在微生物的研究及應(yīng)用中，不僅需要通過分離純化技術(shù)從混雜的天然微生物群中分離出特定的微生物，而且還必須隨時注意保持微生物純培養(yǎng)物的“純潔”，防止其他微生物的混入。在分離、轉(zhuǎn)接及培養(yǎng)純培養(yǎng)物時防止其被其他微生物污染的技術(shù)被稱為無菌技術(shù)（aseptic technique），它是保證微生物學研究正常進行的關(guān)鍵。
　　1. 微生物培養(yǎng)的常用器具及其滅菌
試管、玻璃燒瓶、平皿（culture　dish，Petri dish）等是最為常用的培養(yǎng)微生物的器具，在使用前必須先行滅菌，使容器中不含任何生物。培養(yǎng)微生物的營養(yǎng)物質(zhì)稱為培養(yǎng)基可以加到器皿中后一起滅菌，也可在單獨滅菌后加到無菌的器具中。最常用的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌，它可以殺滅所有的生物，包括最耐熱的某些微生物的休眠體，同時可以基本保持培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分不被破壞。有些玻璃器皿也可采用高溫干熱滅菌。為了防止雜菌，特別是空氣中的雜菌污染，試管及玻璃燒瓶都需采用適宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各種金屬、塑料及硅膠帽，它們只可讓空氣通過，而空氣中的其他微生物不能通過。而平皿是由正反兩平面板互扣而成，這種器具是專為防止空氣中微生物的污染
2. 接種操作
　　用接種環(huán)或接種針分離微生物，或在無菌條件下把微生物由一個培養(yǎng)器皿轉(zhuǎn)接到另一個培養(yǎng)容器進行培養(yǎng)，是微生物學研究中最常用的基本操作。由于打開器皿就可能引起器皿內(nèi)部被環(huán)境中的其他微生物污染，因此微生物實驗的所有操作均應(yīng)在無菌條件下進行，其要點是在火焰附近進行熟練的無菌操作（圖2-1），或在無菌箱或操作室內(nèi)無菌的環(huán)境下進行操作（圖2-2）。操作箱或操作室內(nèi)的空氣可在使用前一段時間內(nèi)用紫外燈或化學藥劑滅菌。有的無菌室通無菌空氣維持無菌狀態(tài)。
　　用以挑取和轉(zhuǎn)接微生物材料的接種環(huán)及接種針，一般采用易于迅速加熱和冷卻的鎳鉻合金等金屬制備，使用時用火焰灼燒滅菌。而移植液體培養(yǎng)物可采用無菌吸管或移液槍。
　　二、用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)
　　單個微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長、繁殖到一定程度可以形成肉眼可見的、有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細胞生長群體，稱為菌落（colony）。當固體培養(yǎng)基表面眾多菌落連成一片時，便成為菌苔（lawn）。不同微生物在特定培養(yǎng)基上生長形成的菌落或菌苔一般都具有穩(wěn)定的特征，可以成為對該微生物進行分類、鑒定的重要依據(jù)（圖2-3）。大多數(shù)細菌、酵母菌、以及許多真菌和單細胞藻類能在固體培養(yǎng)基上形成孤立的菌落，采用適宜的平板分離法很容易得到純培養(yǎng)。所謂平板，即培養(yǎng)平板（culture plate）的簡稱，它是指固體培養(yǎng)基倒入無菌平皿，冷卻凝固后，盛固體培養(yǎng)基的平皿。這方法包括將單個微生物分離和固定在固體培養(yǎng)基表面或里面。固體培養(yǎng)基用瓊脂或其它凝膠物質(zhì)固化的培養(yǎng)基，每個孤立的活微生物體生長、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分離、培養(yǎng)微生物的固體培養(yǎng)基是瓊脂固體培養(yǎng)基平板。這種由Kock建立的采用平板分離微生物純培養(yǎng)的技術(shù)簡便易行，100多年來一直是各種菌種分離的最常用手段。
　　　1. 稀釋倒平板法（pour plate method）
先將待分離的材料用無菌水作一系列的稀釋（如1:10、1:100、1:1,000、1:10,000......），然后分別取不同稀釋液少許，與已熔化并冷卻至50℃左右的瓊脂培養(yǎng)基混合，搖勻后，傾入滅過菌的培養(yǎng)皿中，待瓊脂凝固后，制成可能含菌的瓊脂平板，保溫培養(yǎng)一定時間即可出現(xiàn)菌落。如果稀釋得當，在平板表面或瓊脂培養(yǎng)基中就可出現(xiàn)分散的單個菌落，這個菌落可能就是由一個細菌細胞繁殖形成的。隨后挑取該單個菌落，或重復以上操作數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)。　
2. 涂布平板法（spread plate method）
　　由于將含菌材料先加到還較燙的培養(yǎng)基中再倒平板易造成某些熱敏感菌的死亡，而且采用稀釋倒平板法也會使一些嚴格好氧菌因被固定在瓊脂中間缺乏氧氣而影響其生長，因此在微生物學研究中更常用的純種分離方法是涂布平板法。其做法是先將已熔化的培養(yǎng)基倒入無菌平皿，制成無菌平板，冷卻凝固后，將一定量的某一稀釋度的樣品懸液滴加在平板表面，再用無菌玻璃涂棒將菌液均勻分散至整個平板表面，經(jīng)培養(yǎng)后挑取單個菌落（圖2-4）。
　　3. 平板劃線法（streak plate method）
　　用接種環(huán)以無菌操作沾取少許待分離的材料，在無菌平板表面進行平行劃線、扇形劃線或其他形式的連續(xù)劃線（圖2-5），微生物細胞數(shù)量將隨著劃線次數(shù)的增加而減少，并逐步分散開來，如果劃線適宜的話，微生物能一一分散，經(jīng)培養(yǎng)后，可在平板表面得到單菌落。
　 4. 稀釋搖管法（dilution shake culture method）
　　用固體培養(yǎng)基分離嚴格厭氧菌有它特殊的地方。如果該微生物暴露于空氣中不立即死亡，可以采用通常的方法制備平板，然后置放在封閉的容器中培養(yǎng)，容器中的氧氣可采用化學、物理或生物的方法清除。對于那些對氧氣更為敏感的厭氧性微生物，純培養(yǎng)的分離則可采用稀釋搖管培養(yǎng)法進行，它是稀釋倒平板法的一種變通形式* 。先將一系列盛無菌瓊脂培養(yǎng)基的試管加熱使瓊脂熔化后冷卻并保持在50℃左右，將待分離的材料用這些試管進行梯度稀釋，試管迅速搖動均勻，冷凝后，在瓊脂柱表面傾倒一層滅菌液體石蠟和固體石蠟的混合物，將培養(yǎng)基和空氣隔開。培養(yǎng)后，菌落形成在瓊脂柱的中間（圖2-6）。進行單菌落的挑取和移植，需先用一只滅菌針將液體石蠟--石蠟蓋取出，再用一只毛細管插入瓊脂和管壁之間，吹入無菌無氧氣體，將瓊脂柱吸出，置放在培養(yǎng)皿中，用無菌刀將瓊脂柱切成薄片進行觀察和菌落的移植。
　三、用液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)
　　對于大多數(shù)細菌和真菌，用平板法分離通常是滿意的，因為它們的大多數(shù)種類在固體培養(yǎng)基上長得很好。然而迄今為止并不是所有的微生物都能在固體培養(yǎng)基上生長，例如一些細胞大的細菌、許多原生動物和藻類等，這些微生物仍需要用液體培養(yǎng)基分離來獲得純培養(yǎng)。
　　通常采用的液體培養(yǎng)基分離純化法是稀釋法。接種物在液體培養(yǎng)基中進行順序稀釋，以得到高度稀釋的效果，使一支試管中分配不到一個微生物。如果經(jīng)稀釋后的大多數(shù)試管中沒有微生物生長，那么有微生物生長的試管得到的培養(yǎng)物可能就是純培養(yǎng)物。如果經(jīng)稀釋后的試管中有微生物生長的比例提高了，得到純培養(yǎng)物的機率就會急劇下降。因此，采用稀釋法進行液體分離，必須在同一個稀釋度的許多平行試管中，大多數(shù)（一般應(yīng)超過95%）表現(xiàn)為不生長。
四、單細胞（孢子）分離
　　稀釋法有一個重要缺點，它只能分離出混雜微生物群體中占數(shù)量優(yōu)勢的種類，而在自然界，很多微生物在混雜群體中都是少數(shù)。這時，可以采取顯微分離法從混雜群體中直接分離單個細胞或單個個體進行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)，稱為單細胞（或單孢子）分離法。單細胞分離法的難度與細胞或個體的大小成反比，較大的微生物如藻類、原生動物較容易，個體很小的細菌則較難。
　　對于較大的微生物，可采用毛細管提取單個個體，并在大量的滅菌培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)移清洗幾次，除去較小微生物的污染。這項操作可在低倍顯微鏡，如解剖顯微鏡下進行。對于個體相對較小的微生物，需采用顯微操作儀，在顯微鏡下進行。目前，市場上有售的顯微操作儀種類很多，一般是通過機械、空氣或油壓傳動裝置來減小手的動作幅度，在顯微鏡下用毛細管或顯微針、鉤、環(huán)等挑取單個微生物細胞或孢子以獲得純培養(yǎng)。在沒有顯微操作儀時，也可采用一些變通的方法在顯微鏡下進行單細胞分離，例如將經(jīng)適當稀釋后的樣品制備成小液滴在顯微鏡下觀察，選取只含一個細胞的液體來進行純培養(yǎng)物的分離。單細胞分離法對操作技術(shù)有比較高的要求，多限于高度專業(yè)化的科學研究中采用。
五、選擇培養(yǎng)分離
　　沒有一種培養(yǎng)基或一種培養(yǎng)條件能夠滿足自然界中一切生物生長的要求，在一定程度上所有的培養(yǎng)基都是選擇性的。在一種培養(yǎng)基上接種多種微生物，只有能生長的才生長，其它被抑制。如果某種微生物的生長需要是已知的，也可以設(shè)計一套特定環(huán)境使之特別適合這種微生物的生長，因而能夠從自然界混雜的微生物群體中把這種微生物選擇培養(yǎng)出來，盡管在混雜的微生物群體中這種微生物可能只占少數(shù)。這種通過選擇培養(yǎng)進行微生物純培養(yǎng)分離的技術(shù)稱為選擇培養(yǎng)分離，是十分重要的，特別對于從自然界中分離、尋找有用的微生物。在自然界中，除了極特殊的情況外，在大多數(shù)場合下微生物群落是由多種微生物組成的，因此，要從中分離出所需的特定微生物是十分困難的，尤其當某一種微生物所存在的數(shù)量與其它微生物相比非常少時，單采用一般的平板稀釋方法幾乎是不可能分離到該種微生物的。例如，若某處的土壤中的微生物數(shù)量在108時，必須稀釋到10-6才有可能在平板上分離到單菌落，而如果所需的微生物的數(shù)量僅為102~3，顯然不可能在一般通用的平板上得到該微生物的單菌落。要分離這種微生物，必須根據(jù)該微生物的特點，包括營養(yǎng)、生理、生長條件等，采用選擇培養(yǎng)分離的方法?；蛞种剖勾蠖鄶?shù)微生物不能生長，或造成有利于該菌生長的環(huán)境，經(jīng)過一定時間培養(yǎng)后使該菌在群落中的數(shù)量上升，再通過平板稀釋等方法對它進行純培養(yǎng)分離。
　1. 利用選擇平板進行直接分離
主要根據(jù)待分離微生物的特點選擇不同的培養(yǎng)條件，有多種方法可以采用。例如在從土壤中篩選蛋白酶產(chǎn)生菌時，可以在培養(yǎng)基中添加牛奶或酪素制備培養(yǎng)基平板，微生物生長時若產(chǎn)生蛋白酶則會水解牛奶或酪素，在平板上形成透明的蛋白質(zhì)水解圈。通過菌株培養(yǎng)時產(chǎn)生的蛋白質(zhì)水解圈對產(chǎn)酶菌株進行篩選，可以減少工作量，將那些大量的非產(chǎn)蛋白酶菌株淘汰；再如，要分離高溫菌，可在高溫條件進行培養(yǎng)；要分離某種抗菌素抗性菌株，可在加有抗菌素的平板上進行分離；有些微生物如螺旋體、粘細菌、藍細菌等能在瓊脂平板表面或里面滑行，可以利用它們的滑動特點進行分離純化，因為滑行能使它們自己和其它不能移動的微生物分開?？蓪⑽⑸锶郝潼c種到平板上，讓微生物滑行，從滑行前沿挑取接種物接種，反復進行，得到純培養(yǎng)物。
　　2. 富集培養(yǎng)
　　主要是指利用不同微生物間生命活動特點的不同，制定特定的環(huán)境條件，使僅適應(yīng)于該條件的微生物旺盛生長，從而使其在群落中的數(shù)量大大增加，人們能夠更容易地從自然界中分離到所需的特定微生物。富集條件可根據(jù)所需分離的微生物的特點從物理、化學、生物、及綜合多個方面進行選擇，如溫度、pH、紫外線、高壓、光照、氧氣、營養(yǎng)等等許多方面。圖2-7描述了采用富集方法從土壤中分離能降解酚類化合物對羥基苯甲酸的微生物的實驗過程。首先配制以對羥基苯甲酸為唯一碳源的液體培養(yǎng)基并分裝于燒瓶中，滅菌后將少量的土壤樣品接種于該液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一定時間，原來透明的培養(yǎng)液會變得渾濁，說明已有大量微生物生長。取少量上述培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)液中重新培養(yǎng)，該過程經(jīng)數(shù)次重復后能利用對羥基苯甲酸的微生物的比例在培養(yǎng)物中將大大提高，將培養(yǎng)液涂布于以對羥基苯甲酸為唯一碳源的瓊脂平板，得到的微生物菌落中的大部分都是能降解對羥基苯甲酸的微生物。挑取一部分單菌落分別接種到含有及缺乏對羥基苯甲酸的液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，其中大部分在含有對羥基苯甲酸的培養(yǎng)基中生長，而在沒有對羥基苯甲酸的培養(yǎng)基中表現(xiàn)為沒有生長，說明通過該富集程序的確得到了欲分離的目標微生物。通過富集培養(yǎng)使原本在自然環(huán)境中占少數(shù)的微生物的數(shù)量大大提高后，可以再通過稀釋倒平板或平板劃線等操作得到純培養(yǎng)物。
　　富集培養(yǎng)是微生物學家最強有力的技術(shù)手段之一。營養(yǎng)和生理條件的幾乎無窮盡的組合形式可應(yīng)用于從自然界選擇出特定微生物的需要。富集培養(yǎng)方法提供了按照意愿從自然界分離出特定已知微生物種類的有力手段，只要掌握這種微生物的特殊要求就行。富集培養(yǎng)法也可用來分離培養(yǎng)出由科學家設(shè)計的特定環(huán)境中能生長的微生物，盡管我們并不知道什么微生物能在這種特定的環(huán)境中生長。
　六、二元培養(yǎng)物
　　分離的目的通常是要得到純培養(yǎng)。然而，在有些情況下這是做不到的或是很難作到的。但可用二元培養(yǎng)物作為純化培養(yǎng)的替代物。只有一種微生物的培養(yǎng)物稱為純培養(yǎng)物，含有二種以上微生物的培養(yǎng)物稱為混合培養(yǎng)物，而如果培養(yǎng)物中只含有二種微生物，而且是有意識的保持二者之間的特定關(guān)系的培養(yǎng)物稱為二元培養(yǎng)物。例如二元培養(yǎng)物是保存病毒的最有效途徑，因為病毒是細胞生物的嚴格的細胞內(nèi)寄生物。有一些具有細胞的微生物也是嚴格的其它生物的細胞內(nèi)寄生物，或特殊的共生關(guān)系。對于這些生物，二元培養(yǎng)物是在實驗室控制條件下可能達到的最接近于純培養(yǎng)的培養(yǎng)方法。
　　在自然環(huán)境中，獵食細小微生物的原生動物也很容易用二元培養(yǎng)法在實驗室培養(yǎng)，培養(yǎng)物由原生動物和它獵食的微生物二者組成。例如，纖毛蟲、變形蟲和粘菌。對這些生物，二者的關(guān)系可能并不是嚴格的。這些生物中有些能夠純培養(yǎng)，但是其營養(yǎng)要求往往極端復雜，制備純培養(yǎng)的培養(yǎng)基很困難、很費事。
七、微生物的保藏技術(shù)
　　通過分離純化得到的微生物純培養(yǎng)物，還必須通過各種保藏技術(shù)使其在一定時間內(nèi)不死亡，不會被其它微生物污染，不會因發(fā)生變異而丟失重要的生物學性狀，否則就無法真正保證微生物研究和應(yīng)用工作的順利進行。菌種或培養(yǎng)物保藏是一項最重要的微生物學基礎(chǔ)工作，微生物菌種是珍貴的自然資源，具有重要意義，許多國家都設(shè)有相應(yīng)的菌種保藏機構(gòu)，例如，中國微生物菌種保藏委員會（CCCCM），中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），美國典型菌種保藏中心，美國的“北部地區(qū)研究實驗室”，荷蘭的霉菌中心保藏所，英國的國家典型菌種保藏中心以及日本的大阪發(fā)酵研究所（IFO）等。國際微生物學聯(lián)合會（IAMS）還專門設(shè)立了世界菌種保藏聯(lián)合會（WFGC），用計算機儲存世界上各保藏機構(gòu)提供的菌種數(shù)據(jù)資料，可以通過國際互聯(lián)網(wǎng)查詢和索取，進行微生物菌種的交流、研究和使用。
　　生物的生長一般都需要一定的水分，適宜的溫度和合適的營養(yǎng)，微生物也不例外。菌種保藏就是根據(jù)菌種特性及保藏目的的不同，給微生物菌株以特定的條件，使其存活而得以延續(xù)。例如利用培養(yǎng)基或宿主對微生物菌株進行連續(xù)移種，或改變其所處的環(huán)境條件，例如干燥、低溫、缺氧、避光、缺乏營養(yǎng)等，令菌株的代謝水平降低，乃至完全停止，達到半休眠或完全休眠的狀態(tài)，而在一定時間內(nèi)得到保存，有的可保藏幾十年或更長時間。在需要時再通過提供適宜的生長條件使保藏物恢復活力。
　　1. 傳代培養(yǎng)保藏
　　傳代培養(yǎng)與培養(yǎng)物的直接使用密切相關(guān)，是進行微生物保藏的基本方法。常用的有瓊脂斜面、半固體瓊脂柱及液體培養(yǎng)等。采用傳代法保藏微生物應(yīng)注意針對不同的菌種而選擇使用適宜的培養(yǎng)基，并在規(guī)定的時間內(nèi)進行移種，以免由于菌株接種后不生長或超過時間不能接活，喪失微生物菌種。在瓊脂斜面上保藏微生物的時間因菌種的不同而有較大差異，有些可保存數(shù)年，而有些僅數(shù)周。一般來說，通過降低培養(yǎng)物的代謝或防止培養(yǎng)基干燥，可延長傳代保藏的保存時間。例如在菌株生長良好后，改用橡皮塞封口或在培養(yǎng)基表面覆蓋液體石蠟，并放置低溫保存；將一些菌的菌苔直接刮入蒸餾水或其它緩沖液后，密封置4℃保存，也可以大大提高某些菌的保藏時間及保藏效果，這種方法有時也被稱為懸液保藏法。
　　由于菌種進行長期傳代十分繁瑣，容易污染，特別是會由于菌株的自發(fā)突變而導致菌種衰退，使菌株的形態(tài)、生理特性、代謝物的產(chǎn)量等發(fā)生變化，因此在一般情況下，在實驗室里除了采用傳代法對常用的菌種進行保存外，還必須根據(jù)條件采用其它方法，特別是對那些需要長期保存的菌種更是如此。
　　2. 冷凍保藏
　　將微生物處于冷凍狀態(tài)，使其代謝作用停止以達到保藏的目的。大多數(shù)微生物都能通過冷凍進行保存，細胞體積大者要比小者對低溫更敏感，而無細胞壁者則比有細胞壁者敏感。其原因與低溫會使細胞內(nèi)的水分形成冰晶，從而引起細胞，尤其是細胞膜的損傷。進行冷凍時，適當采取速凍的方法，可因產(chǎn)生的冰晶小而減少對細胞的損傷。當從低溫下移出并開始升溫時，冰晶又會長大，故快速升溫也可減少對細胞的損傷。冷凍時的介質(zhì)對細胞的損傷也有顯著的影響。例如，0.5 mol / L左右的甘油或二甲亞楓可透入細胞，并通過降低強烈的脫水作用而保護細胞；大分子物質(zhì)如糊精、血清蛋白、脫脂牛奶或聚乙烯吡咯烷酮（PVP）雖不能透入細胞，但可通過與細胞表面結(jié)合的方式而防止細胞膜受凍傷。因此，在采用冷凍法保藏菌種時，一般應(yīng)加入各種保護劑以提高培養(yǎng)物的存活率。
　　一般來說，保藏溫度越低，保藏效果越好。在常用的冷凍保藏方法中，液氮保藏可達到—196℃。因此，從適用的微生物范圍、存活期限、性狀的穩(wěn)定性等方面來看，該方法在迄今使用的各種微生物保藏方法中是較理想的一種。但液氮保藏需使用專用器具，一般僅適合一些專業(yè)保藏機構(gòu)采用。與此相應(yīng)，冰箱保藏使用更為普遍。例如在各種基因工程手冊中，一般都推薦在—70℃低溫冰箱中保存菌株或細胞的某些特殊生理狀態(tài)（添加甘油做保護劑），例如經(jīng)誘導建立了感受態(tài)的細胞。在沒有低溫冰箱的條件下，也可利用—20~30℃的普通冰箱保存菌種。但應(yīng)注意加有保護劑的細胞混合物的共融點處在這個溫度范圍內(nèi)，常會由于冰箱可能產(chǎn)生的微小溫度變化引起培養(yǎng)物的反復融化和再結(jié)晶，而對菌體形成強烈的損傷。因此采用普通冰箱冷凍保存菌種的效果往往遠低于低溫冰箱，應(yīng)注意經(jīng)常檢查保藏物的存活情況，隨時轉(zhuǎn)種。
　　3. 干燥保藏法
　　水份對各種生化反應(yīng)和一切生命活動至關(guān)重要，因此，干燥，尤其是深度干燥是微生物保藏技術(shù)中另一項經(jīng)常采用的手段。
　　沙土管保存和冷凍真空保藏是最常用的二項微生物干燥保藏技術(shù)。前者主要適用于產(chǎn)孢子的微生物，如芽孢桿菌、放線菌等。一般將菌種接種斜面，培養(yǎng)至長出大量的孢子后，洗下孢子制備孢子懸液，加入無菌的沙土試管中，減壓干燥，直至將水分抽干，最后用石蠟、膠塞等封閉管口，置冰箱保存。此法簡便易行，并可以將微生物保藏較長時間，適合一般實驗室及以放線菌等為菌種的發(fā)酵工廠采用。
　　冷凍真空保藏是將加有保護劑的細胞樣品預(yù)先冷凍，使其凍結(jié)，然后在真空下通過冰的升華作用除去水分。達到干燥的樣品可在真空或惰性氣體的密閉環(huán)境中置低溫保存，從而使微生物處于干燥、缺氧及低溫的狀態(tài)，生命活動處于休眠，可以達到長期保藏的目的。用冰升華的方式除去水分，手段比較溫和，細胞受損傷的程度相對較小，存活率及保藏效果均不錯，而且經(jīng)抽真空封閉的菌種安瓿管的保存、郵寄、使用均很方便。因此冷凍真空干燥保藏是目前使用最普遍，也是最重要的微生物保藏方法，大多數(shù)專業(yè)的菌種保藏機構(gòu)均采用此法作為主要的微生物保存手段。
　　除上述方法外，各種微生物菌種保藏的方法還有很多，如紙片保藏、薄膜保藏、寄主保藏等。由于微生物的多樣性，不同的微生物往往對不同的保藏方法有不同的適應(yīng)性，迄今為止尚沒有一種方法能被證明對所有的微生物均適宜。因此，在具體選擇保藏方法時必須對被保藏菌株的特性、保藏物的使用特點及現(xiàn)有條件等進行綜合考慮。對于一些比較重要的微生物菌株，則要盡可能多的采用各種不同的手段進行保藏，以免因某種方法的失敗而導致菌種的喪失

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