聚丙烯酰胺;PAM;polyacrylamide

　　聚丙烯酰胺簡(jiǎn)稱PAM、結(jié)構(gòu)式為[－CH2－CH(CONH2)]n－，分子量100～ 500萬(wàn)。聚丙烯酰胺主要有兩種商品形式，一種是粉末狀的，另一種是膠體，還有聚丙烯酰胺乳液(上海合成樹脂研究所研制)。易溶于冷水，速度很慢，高分子量的聚丙烯酰胺當(dāng)濃度超過10％以后．就會(huì)形成凝膠狀結(jié)構(gòu)。提高溫度可以稍微促進(jìn)溶解，但溫度不得超過50℃，以防發(fā)生分子降解。難溶于有機(jī)溶劑。溫度超過120 ℃時(shí)分解。中性。無毒。

用作增稠劑、絮凝劑、減阻劑，具有凝膠、沉降、補(bǔ)強(qiáng)等作用。貯存于陰涼、通風(fēng)、干燥的庫(kù)房?jī)?nèi)，防潮、避光、防熱．存放時(shí)間不宜過長(zhǎng)。

聚丙烯酰胺凝膠

聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(acrylamide，簡(jiǎn)稱Acr)和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺(N，N—methylene-bisacylamide，簡(jiǎn)稱Bis)在加速劑N，N，N￠，N￠—四甲基乙二胺(N，N，N￠，N￠—tetramethyl ethylenedia mine，簡(jiǎn)稱TEMED)和催化劑過硫酸銨(ammonium persulfate (NH4)2S2O8，簡(jiǎn)稱AP)或核黃素(ribofavin即vita min B2，C17H20O6N4)的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。15905967149

聚丙烯酰胺凝膠有下列特性：

(1)在一定濃度時(shí)，凝膠透明，有彈性，機(jī)械性能好；

(2)化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)，在很多溶劑中不溶；

(3)對(duì)pH和溫度變化較穩(wěn)定；

(4)幾乎無吸附和電滲作用，只要Acr純度高，操作條件一致，則樣品分離重復(fù)性好；

(5)樣品不易擴(kuò)散，且用量少，其靈敏度可達(dá)10-6g

(6)凝膠孔徑可調(diào)節(jié)，根據(jù)被分離物的分子量選擇合適的濃度，通過改變單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)凝膠的孔徑；

(7)分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體。因而較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率。

分子量范圍與凝膠濃度的關(guān)系

       分子量范圍                 適用的凝膠濃度/(%)

                     蛋  白  質(zhì)

        <10⁴                           20-30  

        1-4×10⁴                    15-20

     1-5×10⁴-1×10⁵                  10-15      

         1×10⁵                         5-10   

        >5×10⁵                           2-5   

                      核酸(RNA)             

         <10⁴                       15–20     

         10⁴–10⁵                      5-10

       10⁵-2×10⁶                    2-2.6      

ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝膠

在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)SDS即十二烷基磺酸鈉(CH₃-(CH₂)₁₀-CH₂OSO₃- Na+)，是一種陰離子表面活性劑即去污劑， SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，強(qiáng)還原劑β-巰基乙醇或DTT可以斷開半胱氨酸殘基之間的二硫鍵，破壞蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)在一定濃度的含有強(qiáng)還原劑的SDS溶液中，經(jīng)沸水浴煮3～5 min，使蛋白質(zhì) 與SDS分子按比例充分結(jié)合，以使蛋白質(zhì)完全變性和解聚，形成棒狀結(jié)構(gòu)的帶負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物。這種復(fù)合物由于結(jié)合大量的SDS，平均每?jī)蓚€(gè)氨基酸殘基結(jié)合一個(gè)SDS 分子，這時(shí)各種蛋白質(zhì)分子本身的電荷完全被SDS 掩蓋，使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)形成僅保持原有分子大小為特征的負(fù)離子團(tuán)塊，從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異。由于SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合是按重量成比例的，因此在進(jìn)行電泳時(shí)，蛋白質(zhì)分子的遷移 速度僅取決于分子大小。SDS 與蛋白質(zhì)結(jié)合后使蛋白質(zhì)－SDS 復(fù)合物上帶有大量的負(fù)電荷，當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW為分 子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)，若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量對(duì)數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它 的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。
    樣品處理液中通常還加入溴酚藍(lán)染料，用于控制電泳過程。另外樣品處理液中也可加入適量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加樣時(shí)樣品溶液可以沉入樣品凹槽底部。

制膠

SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳是最常用的定性分析蛋白質(zhì)的電泳方法，特別是用于蛋白質(zhì)純度檢測(cè)和測(cè)定蛋白質(zhì)分子量。

制備凝膠時(shí)首先要根據(jù)待分離樣品的情況選擇適當(dāng)?shù)姆蛛x膠濃度，例如通常使用的15％的聚丙烯酰胺凝膠的分離范圍是10⁴～10⁵，即分子量小于10⁴的蛋白質(zhì)可以不受孔徑的阻礙而通過凝膠，而分子量大于10⁵的蛋白質(zhì)則難以通過凝膠孔徑，這兩種情況的蛋白質(zhì)都不能得到分離。所以如果要分離較大的蛋白質(zhì)，需要使用低濃度如10％或7.5%的凝膠(孔徑較大)；而對(duì)于分離較小的蛋白質(zhì)，使用的較高濃度凝膠(孔徑較小)可以得到更好的分離效果。分離膠聚合后，通常在上面加上一層濃縮膠(約1cm)，并在濃縮膠上插入樣品梳，形成上樣凹槽。濃縮膠是低濃度的聚丙烯酰胺凝膠，由于濃縮膠具有較大的孔徑(丙烯酰胺濃度通常為3～5％)，各種蛋白質(zhì)都可以不受凝膠孔徑阻礙而自由通過。濃縮膠通常pH 值較低(通常pH = 6.8)，用于樣品進(jìn)入分離膠前將樣品濃縮成很窄的區(qū)帶。濃縮膠聚合后取出樣品梳，上樣后即可通電開始電泳。

聚丙烯酰胺凝膠電泳和SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠電泳和SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳有兩種系統(tǒng)，即只有分離膠的連續(xù)系統(tǒng)和有濃縮膠與分離膠的不連續(xù)系統(tǒng)，不連續(xù)系統(tǒng)中最典型、國(guó)內(nèi)外均廣泛使用的是著名的Ornstein-Davis 高pH 堿性不連續(xù)系統(tǒng)，其濃縮膠丙烯酰胺濃度為4％，pH = 6.8，分離膠的丙烯酰胺濃度為12.5％，pH =8.8。電極緩沖液的pH = 8.3，用Tris、SDS 和甘氨酸配制。配膠的緩沖液用Tris、SDS 和HCl 配制。

    樣品在電泳過程中首先通過濃縮膠，在進(jìn)入分離膠前由于等速電泳現(xiàn)象而被濃縮。這是由于在電泳緩沖液中主要存在三種陰離子，CL－、甘氨酸陰離子以及蛋白質(zhì)－SDS 復(fù)合物，在濃縮膠的pH 值下，甘氨酸只有少量的電離，所以其電泳遷移率最小，而CL－的電泳遷移率最大。在電場(chǎng)的作用下，CL－最初的遷移速度最快，這樣在CL－后面形成低離子濃度區(qū)域，即低電導(dǎo)區(qū)，而低電導(dǎo)區(qū)會(huì)產(chǎn)生較高的電場(chǎng)強(qiáng)度，因此CL－后面的離子在較高的電場(chǎng)強(qiáng)度作用下會(huì)加速移動(dòng)。達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)后，CL－和甘氨酸之間形成穩(wěn)定移動(dòng)的界面。而蛋白質(zhì)－SDS 復(fù)合物由于相對(duì)量較少，聚集在甘氨酸和Cl－的界面附近而被濃縮成很窄的區(qū)帶(可以被濃縮三百倍)，所以在濃縮膠中CL－是快離子(前導(dǎo)離子)，甘氨酸是慢離子(尾隨離子)。當(dāng)甘氨酸到達(dá)分離膠后，由于分離膠的pH 值(通常pH = 8.8)較大，甘氨酸離解度加大，電泳遷移速度變大超過蛋白質(zhì)－SDS 復(fù)合物，甘氨酸和Cl－的界面很快超過蛋白質(zhì)－SDS 復(fù)合物。這時(shí)蛋白質(zhì)－SDS 復(fù)合物在分離膠中以本身的電泳遷移速度進(jìn)行電泳，向正極移動(dòng)。由于蛋白質(zhì)－SDS 復(fù)合物在單位長(zhǎng)度上帶有相等的電荷，所以它們以相等的遷移速度從濃縮膠進(jìn)入分離膠，進(jìn)入分離膠后，由于聚丙烯酰胺的分子篩作用，小分子的蛋白質(zhì)可以容易的通過凝膠孔徑，阻力小，遷移速度快；大分子蛋白質(zhì)則受到較大的阻力而被滯后，這樣蛋白質(zhì)在電泳過程中就會(huì)根據(jù)其各自分子量的大小而被分離。溴酚藍(lán)指示劑是一個(gè)較小的分子，可以自由通過凝膠孔徑，所以它顯示著電泳的前沿位置。當(dāng)指示劑到達(dá)凝膠底部時(shí)，停止電泳，從平板中取出凝膠。在適當(dāng)?shù)娜旧褐?/span>(如通常使用的考馬斯亮藍(lán))染色幾個(gè)小時(shí)，而后過夜脫色。脫色液去除凝膠中未與蛋白結(jié)合的背底染料，這時(shí)就可以清晰地觀察到凝膠中被染色的蛋白質(zhì)區(qū)帶。通常凝膠制備需要1～1.5小時(shí)，電泳在25～30mA 下通常需要3小時(shí)，染色2～3小時(shí)，過夜脫色。通常使用的垂直平板電泳可以同時(shí)進(jìn)行多個(gè)樣品的電泳。Ornstein 和Davis 設(shè)計(jì)的高pH 堿性不連續(xù)系統(tǒng)，有其獨(dú)特的特點(diǎn)。根據(jù)Henderson-Hasselbalch公式：pH=pKa + lg([Base]/[Acid])

式中的“α”是緩沖液中各種分子的離解度。由上式可以看出：①濃縮膠的pH(6.8)小于慢離子甘氨酸的pKa(9.8)3個(gè)pH 左右，所以 α≈ 0.001，即在濃縮膠中甘氨酸只有0.1％離解，因此在電場(chǎng)中遷移很慢，是慢離子;②快離子Cl－由于幾乎全部離解，電泳遷移率最大，不受pH 變化的影響;③分離膠的pH(8.8)小于慢離子的pKa 一個(gè)pH 左右，α≈ 0.1，所以在分離膠中甘氨酸離解加大，電泳遷移率加大，就趕到蛋白質(zhì)帶的前面。
    此外還可以總結(jié)出該系統(tǒng)的特點(diǎn)有：電極緩沖液中共軛堿Tris 的pKa 小于分離膠的pH 約１個(gè)pH，使其緩沖能力大。電極緩沖液的pH 為8.3，相近于Tris 的pKa(8.1)，以便獲得最大的緩沖能力。SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳還可以用于未知蛋白分子量的測(cè)定，在同一凝膠上對(duì)一系列已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白及未知蛋白進(jìn)行電泳，測(cè)定各個(gè)的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的電泳距離(或遷移率)，并對(duì)各自分子量的對(duì)數(shù)(log Mr)作圖，即得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)定未知蛋白質(zhì)的電泳距離(或遷移率)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以求出未知蛋白的分子量。
SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳經(jīng)常應(yīng)用于提純過程中純度的檢測(cè)，純化的蛋白質(zhì)通常在SDS 電泳上應(yīng)只有一條帶，但如果蛋白質(zhì)是由不同的亞基組成的，它在電泳中可能會(huì)形成分別對(duì)應(yīng)于各個(gè)亞基的幾條帶。SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳具有較高的靈敏度，一般只需要不到微克量級(jí)的蛋白質(zhì)，而且通過電泳還可以同時(shí)得到關(guān)于分子量的情況，這些信息對(duì)于了解未知蛋白及設(shè)計(jì)提純過程都是非常重要的。

SDS-PAGE膠制備

一. 實(shí)驗(yàn)原理：
SDS-PAGE是對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行量化，比較及特性鑒定的一種經(jīng)濟(jì)、快速、而且可重復(fù)的方法。該法是依據(jù)混合蛋白的分子量不同來進(jìn)行分離的。
SDS是一種去垢劑，可與蛋白質(zhì)的疏水部分相結(jié)合，破壞其折疊結(jié)構(gòu)，并使其廣泛存在于一個(gè)廣泛均一的溶液中。SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物的長(zhǎng)度與其分子量成正比。在樣品介質(zhì)和凝膠中加入強(qiáng)還原劑和去污劑后，電荷因素可被忽略。蛋白亞基的遷移率取決于亞基分子量。
二. 試劑和器材：
試劑：1. 5x樣品緩沖液（10ml）:0.6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50％甘油，2ml 10％的SDS，0.5ml巰基乙醇，1ml 1％溴酚藍(lán)，0.9ml蒸餾水?？稍?/span>4℃保存數(shù)周，或在－20℃保存數(shù)月。
2. 凝膠貯液：在通風(fēng)櫥中，稱取丙烯酰胺30g，甲叉雙丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。過濾后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1個(gè)月。
3. pH8.9分離膠緩沖液： Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，調(diào)pH8.9，定容至100ml， 4℃保存。
4. pH6.7濃縮膠緩沖液： Tris 5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，調(diào)pH6.7，定容至100ml， 4℃保存。
5. TEMED（四乙基乙二胺）原液
6.10％過硫酸銨（用重蒸水新鮮配制）
7. pH8.3 Tris-甘氨酸電極緩沖液：稱取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸餾水約900ml，調(diào)pH8.3后，用蒸餾水定容至1000ml。置4℃保存，臨用前稀釋10倍。
8. 考馬斯亮藍(lán)G250染色液：稱100mg考馬斯亮藍(lán)G250，溶于200ml蒸餾水中，慢慢加入7.5ml 70％的過氯酸，最后補(bǔ)足水到250ml，攪拌1小時(shí)，小孔濾紙過濾。
器材：電泳儀，電泳槽，水浴鍋，搖床。

三. 實(shí)驗(yàn)操作；
（一）樣品制備
將蛋白質(zhì)樣品與5X樣品緩沖液（20ul＋5ul）在一個(gè)Eppendorf管中混合。放入100℃加熱5－10min，取上清點(diǎn)樣。
（二）分離膠及濃縮膠的制備

1 將玻璃板、樣品梳、Spacer用洗滌劑洗凈，用ddH₂O沖洗數(shù)次，再用乙醇擦拭，晾干；
2 將兩塊洗凈的玻璃板之間加入Spacer，按照Bio-Rad Mini Ⅱ/Ⅲ說明書提示裝好玻璃板；
3 按如下體積配制10％分離膠8.0 ml，混勻；
ddH₂O 3.0 ml
1.0 mol/LTris-HCl pH=8.8 2.1 ml
30％ Acr-Bis 2.8 ml
10％ SDS 80 ul
10％AP 56 ul
TEMED 6 ul
4 向玻璃板間灌制分離膠，立即覆一層重蒸水，大約20 min后膠即可聚合；
5 按如下體積配制6％濃縮膠3.0 ml，混勻；ddH₂O 1.0 mol/LTris-HClpH=6.8 30％ Acr-Bis
2.0 ml 400 ul 600 ul
10％ SDS 10％ AP TEMED
36ul 24ul 4ul
6 將上層重蒸水傾去，濾紙吸干，灌制濃縮膠，插入樣品梳；
7 裝好電泳系統(tǒng)，加入電極緩沖液，上樣20 μl;
8 穩(wěn)壓200V，溴酚藍(lán)剛跑出分離膠時(shí)，停止電泳，約需45 min～1hr.
9 卸下膠板，剝離膠放入染色液中，室溫染色1～2 hr；加入脫色液，置于80 rpm脫色搖床上,每20 min更換一次脫色液（10 ml 冰乙酸；45 ml乙醇；45 ml蒸餾水）至完全脫凈。

附：

DTT

DTT即DL-Dithiothreitol，中文名為二硫蘇糖醇。分子式為C₄H₁₀O₂S₂，分子量為154.25，純度>99%。

　　常用還原劑，有抗氧化作用，進(jìn)口分裝。DTT和巰基乙醇相比，作用相似，但DTT的刺激性氣味要小很多，毒性也比巰基乙醇低很多。而且DTT比巰基乙醇的濃度低7倍時(shí)，兩者效果相近，但DTT價(jià)格略高一些。

　　DTT是一種很強(qiáng)的還原劑，其還原性很大程度上是由于其氧化狀態(tài)六元環(huán)（含二硫鍵）的構(gòu)象穩(wěn)定性。它的氧化還原電勢(shì)在pH為7時(shí)為-0.33伏。

　　DTT的用途之一是作為巰基化DNA的還原劑和去保護(hù)劑。巰基化DNA末端硫原子在溶液中趨向于形成二聚體，特別是在存在氧氣的情況下。這種二聚化大大降低了一些偶聯(lián)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)（如DNA在生物感應(yīng)器中的固定）的效率；而在DNA溶液中加入DTT，反應(yīng)一段時(shí)間后除去，就可以降低DNA的二聚化。

　　DTT也常常被用于蛋白質(zhì)中二硫鍵的還原，可用于阻止蛋白質(zhì)中的半胱氨酸之間所形成的蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間二硫鍵。但DTT往往無法還原包埋于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)部（溶劑不可及）的二硫鍵，這類二硫鍵的還原常常需要先將蛋白質(zhì)變性（高溫加熱或加入變性劑，如6M 鹽酸胍、8M 尿素或1% SDS）。反之，根據(jù)DTT存在情況下，二硫鍵還原速度的不同，可以判斷其包埋程度的深淺。

　　由于容易被空氣氧化，因此DTT的穩(wěn)定性較差；但冷凍保存或在惰性氣體中處理能夠延長(zhǎng)它的使用壽命。由于質(zhì)子化的硫的親核性較低，隨著pH值的降低，DTT的有效還原性也隨之降低；而Tris(2-carboxyethyl)phosphine HCl（TCEP鹽酸鹽）可以作為低pH值條件下DTT的替代品，而且也比DTT更為穩(wěn)定。

　　1mol/L二硫蘇糖醇（DTT）溶液

　　【配制方法】用20ml 0.01mol/L乙酸鈉溶液（pH5.2）溶解3.09g DTT，過濾除菌后分裝成1ml小份貯存于-20℃。

　　【注意】DTT或含有DTT的溶液不能進(jìn)行高壓處理。

　　DTT：Deloitte Touche Tohmatsu 德勤全球，即德勤會(huì)計(jì)事務(wù)所的上級(jí)公司。